脐带间充质干细胞来源的外泌体-温敏水凝胶的构建及侵入性观察

摘要

目的构建脐带间充质干细胞来源的外泌体-温敏水凝胶,观察其温敏性和侵入性。方法取脐带间充质干细胞株Saliai-HMSC(UC)-N,采用沉淀法提取外泌体,PBS重悬后获得脐带间充质干细胞来源的外泌体重悬液。取Pluronic F-127粉末,避光条件下按20%、22%、24%、26%、28%的浓度梯度分别加入脐带间充质干细胞来源的外泌体重悬液,吹打、静置后,即得到20%、22%、24%、26%、28%浓度的外泌体-温敏水凝胶溶液。将不同浓度的外泌体-温敏水凝胶溶液加入恒温水浴锅,测定初始凝胶化温度、37℃初始凝胶时间。使用PKH67对外泌体进行标记,配置PKH67标记的脐带间充质干细胞来源的外泌体重悬液和PKH67标记的24%浓度的外泌体-温敏水凝胶溶液。取脐静脉内皮细胞分成外泌体组、外泌体-温敏水凝胶组。外泌体组加入PKH67标记的脐带间充质干细胞来源的外泌体重悬液,外泌体-温敏水凝胶组加入PKH67标记的24%浓度的外泌体-温敏水凝胶溶液。两组细胞避光孵育12 h后,滴加稀释的DAPI细胞核染色液,避光孵育30 min,置于荧光倒置显微镜下观察细胞内绿色荧光(绿色荧光为PKH67标记的外泌体)分布情况,并使用Image J软件计算绿色荧光光密度百分比、绿色荧光面积百分比。结果20%、22%、24%、26%、28%浓度的外泌体-温敏水凝胶溶液的初始凝胶化温度分别为(17.8±0.7)、(16.6±0.3)、(14.6±0.5)、(13.4±0.3)、(12.4±0.1)℃,37℃初始凝胶时间分别为(92±6)、(79±5)、(68±3)、(51±3)、(46±2)s,各浓度外泌体-温敏水凝胶溶液的初始凝胶化温度、37℃初始凝胶时间相比,P均<0.05,表明随着温度的变化,外泌体-温敏水凝胶的温敏特性随之变化,而24%浓度的外泌体-温敏水凝胶溶液应用更为简便。外泌体组、外泌体-温敏水凝胶组绿色荧光点分布在细胞质内,并于细胞核周围富集。外泌体组绿色荧光光密度百分比、绿色荧光面积百分比分别为0.02%±0.01%、0.11%±0.01%,外泌体-温敏水凝胶组绿色荧光光密度百分比、绿色荧光面积百分比分别为0.21%±0.05%、1.30%±0.12%,两组相比,P均<0.05。结论成功构建了脐带间充质干细胞来源的外泌体-温敏水凝胶,具有良好的温敏性和侵入性。