蔬菜土传病原菌三重PCR检测体系的建立与应用

摘要

[目的]针对生产中危害严重的3种蔬菜土传病原菌瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、大丽轮枝菌(Verticillium dahliae),建立三重PCR(triplex PCR)检测体系,为蔬菜土传真菌病害的早期诊断和鉴定提供技术与方法.[方法]筛选3种病原菌特异性引物组合,通过设定不同的PCR退火温度、引物浓度、循环次数以及延伸时间,探索影响三重PCR扩增的因素,建立蔬菜土传病原菌三重PCR检测体系,并对体系灵敏度进行检测.为了验证建立体系的稳定性,选择2×Taq Master PCR Mix(北京博迈德生物技术有限公司)和TaKaRa Taq酶(大连宝生物工程有限公司)2个不同公司的试剂,分别利用C1000 TouchTM型(赛默飞世尔科技有限公司)与AerisTM型(新加坡艺思高科技有限公司)热循环仪进行三重PCR反应,比较检测结果的可重复性.对田间采集的35份病害样本和149份土壤样本,分别进行三重PCR和病原菌分离检测,以确定所建立得三重PCR检测体系的适用性.[结果]三重PCR反应体系中引物对AsAPH2B/AsPyF、FOF1/FOR1、VActF/VActR可分别扩增出瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌长度为163、328和530 bp的特异性目的片段.反应体系(25μL):0.12μmol·L-1 AsAPH2B/AsPyF,0.16μmol·L-1 FOF1/FOR1,0.24μmol·L-1 VActF/VActR,2×Taq Master PCR Mix 12.5μL,退火温度为60.8℃,35个循环.该体系对病原菌纯培养物的检测灵敏度为10-1ng·μL-1,对土壤中大丽轮枝菌、尖镰孢和瓜果腐霉的检测灵敏度分别为105、106个孢子/g土壤和10-2 mg菌丝/g土壤.分别采用2×Taq Master PCR Mix和TaKaRa Taq酶,利用C1000 TouchTM型和AerisTM型热循环仪进行三重PCR,扩增结果一致,说明三重PCR体系检测稳定性好.对田间采集的病害和土壤样本进行检测,25份病害样本和71份土壤样本中检测出带菌,三重PCR检测与病原菌分离培养结果一致.[结论]本研究建立的瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌三重PCR检测体系具有灵敏度高、稳定性和重复性好的特点,能够快速、准确地检测田间病株及其根围土壤中的瓜果腐霉、尖镰孢、大丽轮枝菌,为蔬菜土传病害的早期预防和流行监测提供了有效的技术手段.