活性氧在贝伐单抗诱导视网膜色素上皮细胞上皮间质转化中的作用

摘要

目的 观察贝伐单抗(BEV)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激损伤和上皮间质转化(EMT)的影响,进一步探讨抑制活性氧(ROS)在EMT中的作用.方法 选取人ARPE-19细胞株,根据实验需要将ARPE-19细胞分为4组:空白对照组、BEV组、BEV+NAC组和BEV+DPI组,其中空白对照组细胞不进行任何干预,BEV组用0.25 g·L-1 BEV处理细胞72 h,另外两组在BEV处理细胞24 h后分别再用ROS抑制剂NAC和NADPH氧化酶抑制剂DPI处理细胞48 h.采用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色观察各组ARPE-19细胞内ROS和H2 O2的生成堆积情况;细胞免疫荧光观察各组ARPE-19细胞中EMT标志物[紧密连接相关蛋白闭锁带蛋白-1(ZO-1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤维连接蛋白(FN)]的表达情况;再通过RT-PCR和Western blot检测各组细胞中EMT标志物的mRNA和蛋白的表达水平.结果 DCFH-DA染色观察发现,ARPE-19细胞加入BEV继续培养后,ROS和H2 O2表达均明显上调(均为P<0.05).与空白对照组相比,BEV组EMT指标变化显著:上皮标志物ZO-1的表达降低,间质标志物α-SMA和FN的表达升高,两组间各指标相比差异均有统计学意义(均为P<0.05);与BEV组相比,BEV+NAC组和BEV+DPI组中各项指标mRNA表达变化显著,ZO-1上升至0.955±0.048、1.056±0.017,而α-SMA下降至0.982±0.165、1.058±0.165,此外FN表达(0.666±0.063、0.983±0.125)也显著降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05).各种因子的蛋白表达变化趋势与其相应mRNA表达相一致,与单纯BEV组相比,ROS抑制剂NAC和NADPH氧化酶抑制剂DPI都显著改变了EMT标志物的表达,ZO-1蛋白相对表达量升高了0.195±0.010、0.770±0.175,而α-SMA下降了0.353±0.098、0.482±0.037,FN下降了0.528±0.161、0.612±0.134,差异均有统计学意义(均为P<0.05).结论 ROS参与了BEV诱导的RPE细胞EMT,抑制ROS可减轻BEV诱导的人RPE细胞的EMT程度.