自噬在高糖条件下视网膜色素上皮细胞表达血管内皮生长因子促进RF/6A细胞血管生成中的作用

摘要

目的 研究高糖条件下诱导的人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19)自噬对其表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),及恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A)迁移和管腔形成的影响.方法 根据不同干预将ARPE-19细胞随机分为对照组、高糖组及3-甲基腺嘌呤(3-MA)+高糖组.对照组细胞在无糖DMEM培养基中常规培养24h,高糖组细胞在DMEM培养基中加入30 mmol·L-1葡萄糖溶液处理24h,3-MA+高糖组细胞先用10 mmol·L-1 3-MA处理24h,然后更换培养基再加入30 mmol·L-1葡萄糖溶液处理24 h.Western blot法检测细胞自噬标志性蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule-related protein 1 light chain 3,LC3) Ⅱ型和Ⅰ型的比值(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)、Beclin-1及细胞中自噬相关基因3(autophagyrelated gene 3,Atg3)的蛋白表达.ELISA法检测ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达.比较三组ARPE-19细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、Atg3及VEGF的蛋白表达量.然后将以上三组ARPE-19细胞上清液分别加入RF/6A细胞培养基中,将RF/6A细胞也按以上方法分组,分别采用Transwell法及Matrigel胶法检测并比较三组RF/6A细胞迁移数及细胞管腔形成数.结果 对照组、高糖组和3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别为0.405±0.095、0.932±0.024和0.635±0.048;Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.205±0.035、0.590±0.120和0.425±0.082;Atg3蛋白相对表达量分别为0.277±0.035、0.539±0.071和0.389±0.019.ARPE-19细胞上清液中VEGF的蛋白表达量三组分别为(44.03±9.08)ng·L-1、(205.70±17.90) ng·L-1和(112.52±21.06)ng·L-1;RF/6A细胞迁移数三组分别为(125.60±6.35)个、(153.60±19.20)个和(67.40±7.95)个;细胞管腔形成数三组分别为(12.22±0.84)个、(18.44±1.68)个和(5.44±0.51)个;整体比较差异均有统计学意义(均为P＜0.01).与对照组相比,高糖组ARPE-19细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1及Atg3蛋白相对表达量均明显增加(均为P＜0.01),VEGF表达水平均明显升高(P＜0.01),RF/6A细胞迁移数和管腔形成数均明显增加(均为P＜0.01),3-MA+高糖组ARPE-19细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1和Atg3蛋白相对表达量、VEGF表达量、RF/6A细胞迁移数和细胞管腔形成数均较高糖组明显降低(均为P＜0.01).结论 高糖激活ARPE-19细胞自噬,进而上调VEGF的表达并促进RF/6A细胞迁移和管腔形成,自噬抑制剂3-MA可抑制ARPE-19细胞自噬,并下调VEGF的表达从而抑制RF/6A细胞的血管形成能力.