透明质酸合成促进剂、HAS2mRNA表达促进剂、具有透明质酸合成促进作用的医药品、食品或化妆料及具有HAS2mRNA表达促进作用的医药品、食品或化妆料

摘要

一种透明质酸合成促进剂或HAS2mRNA表达促进剂，其含有通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的馏分中至少包含白杨素的第1馏分，纯化第1馏分所得到的其他的馏分或白杨素作为有效成分。此外，本发明的课题在于提供含有本发明的透明质酸合成促进剂或HAS2mRNA表达促进剂的医药品、食品或化妆料。本发明的透明质酸合成促进剂、HAS2mRNA表达促进剂、医药品、食品或化妆料为使用从安全性高的千张纸所得到的馏分或成分的有用的物质而成。

说明书

技术领域

本发明涉及透明质酸合成促进剂、HAS2mRNA表达促进剂、具有透明质酸合成促进作用的医药品、食品或化妆料及具有HAS2mRNA表达促进作用的医药品、食品或化妆料。

背景技术

透明质酸(也称作玻尿酸)为由N-乙酰葡糖胺及葡萄糖醛酸构成的高分子(氨基葡聚糖)，具有高的保水力。已知透明质酸是作为含有水的凝胶状的物质广见于生物体内的细胞外基质，与生物组织(特别是皮肤组织)的粘弹性保持、生物组织的保湿、关节部软骨的功能维持等相关。此外，透明质酸也具有阻止高分子物质由细胞外进入到细胞内、调节细胞的移动或增殖、成为信息传递(signal transduction)的场所等的功能。

可是，生物体内的透明质酸的量因各种压力、紫外线、加龄等而降低。已知生物体内的透明质酸的量减少时，就会发生因干燥造成的皮肤的不正常(皱纹、松弛及干燥粗糙)或关节痛等的症状。作为生物体内的透明质酸的量减少的直接原因可举出：由于透明质酸酶(透明质酸分解酶)或紫外线而使透明质酸被分解，或生物体内的透明质酸的产生量减少。

因此，若能补充或增加生物体内的透明质酸的量，则可期待皮肤的不正常或关节痛等的症状的预防、抑制及改善或正常化。

以往作为生物体内的具有透明质酸的合成促进作用的成分，在表皮中视黄酸，在真皮中TGF-β1广为人知。此外，作为生物体内的具有透明质酸的合成促进作用的物质，已知有各式各样的天然产物及其馏分(fraction)(例如来自蘑菇(Agaricus)的提取物)(例如参照引用文献1)。

另一方面，已知以来自千张纸(Oroxylum indicum，有时也被称作玉蝴蝶或木蝴蝶，详细在后述。)的提取物为有效成分而含有的抗氧化剂(例如参照引用文献2)。应予说明，千张纸为在原产地有时也被作为食用而被使用的安全的天然产物。

然而，对于含有以如下作为有效成分的透明质酸合成促进剂仍未知：来自千张纸的提取物或其纯化物，特别是通过水性有机溶剂从千张纸的种子提取的馏分、由该馏分分割的规定的馏分、或包含于千张纸的白杨素(chrysin)。

而且，已知有在生物体内(特别是细胞表面)进行透明质酸的合成的酶的HAS2(透明质酸合成酶2)。HAS2是通过HAS2mRNA表达而被合成。也就是说，为了补充或增加生物体内的透明质酸的量，促进HAS2mRNA的表达有效。

与透明质酸合成促进剂的情形一样，对于含有以如下作为有效成分的HAS2mRNA表达促进剂也未知：通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的馏分、或包含于千张纸的白杨素。

现有技术文献

专利文献

专利文献1日本国特开2013－035835号公报

专利文献2日本国特开2006－321730号公报

发明内容

本发明所要解决的技术课题为提供“使用从安全性高的千张纸所得到的馏分或成分的透明质酸合成促进剂”。此外，其所要解决的技术课题也在于提供“使用从安全性高的千张纸所得到的馏分或成分的HAS2mRNA表达促进剂”。此外，其所要解决的技术课题也在于提供“含有本发明的透明质酸合成促进剂，具有透明质酸合成促进作用的医药品、食品或化妆料”。进而，其所要解决的技术课题也在于提供“含有本发明的HAS2mRNA表达促进剂，具有HAS2mRNA表达促进作用的医药品、食品或化妆料”。

本发明的发明者们深刻研究的结果，判明了来自千张纸的提取物或其纯化物之中，“通过水性有机溶剂从千张纸的种子提取的馏分”、“由该馏分分馏的规定的馏分”及“白杨素”具有透明质酸合成促进作用。此外，由针对其机制(mechanism)的研究，也判明了上述各馏分及成分具有HAS2mRNA表达促进作用。

本发明的发明者们由以上的知识达到了完成本发明。本发明由以下的事项所构成。

(1)一种透明质酸合成促进剂，其特征在于，含有通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的馏分中至少包含白杨素的第1馏分作为有效成分。

(2)一种透明质酸合成促进剂，其特征在于，含有以水及乙酸乙酯对通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的第1馏分进行液-液分配时，被分配在所述乙酸乙酯侧的馏分中至少包含白杨素的第2馏分作为有效成分。

(3)一种透明质酸合成促进剂，其特征在于，含有以水及乙酸乙酯对通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的第1馏分进行液-液分配，通过90％甲醇及己烷进一步对被分配在所述乙酸乙酯侧的第2馏分进行液-液分配时，被分配在所述90％甲醇侧的馏分中至少包含白杨素的第3馏分作为有效成分。

(4)一种透明质酸合成促进剂，其特征在于，含有以水及乙酸乙酯对通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的第1馏分进行液-液分配，通过90％甲醇及己烷进一步对被分配在所述乙酸乙酯侧的第2馏分进行液-液分配，通过硅胶层析法对被分配在所述90％甲醇侧的第3馏分进行分馏时，通过氯仿：甲醇为9：1的混合溶剂由硅胶所溶出的馏分中至少包含白杨素的第4馏分作为有效成分。

(5)一种透明质酸合成促进剂，其特征在于，含有白杨素作为有效成分。

(6)一种HAS2mRNA表达促进剂，其特征在于，含有通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的馏分中至少包含白杨素的第1馏分作为有效成分。

(7)一种HAS2mRNA表达促进剂，其特征在于，含有以水及乙酸乙酯对通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的第1馏分进行液-液分配时，被分配在所述乙酸乙酯侧的馏分中至少包含白杨素的第2馏分作为有效成分。

(8)一种HAS2mRNA表达促进剂，其特征在于，含有以水及乙酸乙酯对通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的第1馏分进行液-液分配，通过90％甲醇及己烷进一步对被分配在所述乙酸乙酯侧的第2馏分进行液-液分配时，被分配在所述90％甲醇侧的馏分中至少包含白杨素的第3馏分作为有效成分。

(9)一种HAS2mRNA表达促进剂，其特征在于，含有以水及乙酸乙酯对通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的第1馏分进行液-液分配，通过90％甲醇及己烷进一步对被分配在所述乙酸乙酯侧的第2馏分进行液-液分配，通过硅胶层析法对被分配在所述90％甲醇侧的第3馏分进行分馏时，通过氯仿：甲醇为9：1的混合溶剂由硅胶所溶出的馏分中至少包含白杨素的第4馏分作为有效成分。

(10)一种HAS2mRNA表达促进剂，其特征在于，含有白杨素作为有效成分。

(11)一种具有透明质酸合成促进作用的医药品、食品或化妆料，其特征在于，含有上述(1)～(5)中任一项所述的透明质酸合成促进剂。

(12)一种具有HAS2mRNA表达促进作用的医药品、食品或化妆料，其特征在于，含有上述(6)～(10)中任一项所述的HAS2mRNA表达促进剂。

依照本发明，也可由后述的试验例可知，可提供“使用从安全性高的千张纸所得到的馏分或成分的透明质酸合成促进剂”，“使用从安全性高的千张纸所得到的馏分或成分的HAS2mRNA表达促进剂”，“含有本发明的透明质酸合成促进剂且具有透明质酸合成促进作用的医药品，食品或化妆料”以及“含有本发明的HAS2mRNA表达促进剂且具有HAS2mRNA表达促进作用的医药品，食品或化妆料”。

应予说明，在本说明书及各附图中，对于浓度仅记载为(％)时，是表示以体积/体积(V/V)算出的百分浓度。

本发明中的白杨素(chrysin，5，7-dihydroxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one)是下列的式(1)所记载的化合物，

附图说明

图1为用于说明实施方式1～5中的第1馏分～第4馏分及白杨素而显示的流程图。

图2为用于说明试验例1～5中的试样a～e而显示的流程图。

具体实施方式

以下，基于实施方式对本发明的透明质酸合成促进剂，HAS2mRNA表达促进剂，具有透明质酸合成促进作用的医药品、食品或化妆料及具有HAS2mRNA表达促进作用的医药品、食品或化妆料进行说明。

[实施方式]

图1为用于说明实施方式1～5中的第1馏分～第4馏分及白杨素而显示的流程图。应予说明，在图1中第4馏分与白杨素之间以虚线连接如后述，是为了实施方式5中的白杨素不被限定于由第4馏分单离的物质。

本发明的透明质酸合成促进剂及HAS2mRNA表达促进剂含有上述(1)～(10)所记载的第1馏分、第2馏分、第3馏分、第4馏分或白杨素作为有效成分。

以下对上述的各个有效成分通过图1及实施方式1～5进行说明。此外，对上述的含有透明质酸合成促进剂或HAS2mRNA表达促进剂的医药品、食品或化妆料通过实施方式6进行说明。

[实施方式1]

与实施方式1有关的透明质酸合成促进剂及HAS2mRNA表达促进剂为含有通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的馏分中至少包含白杨素的第1馏分作为有效成分。

千张纸(Oroxylum indicum)为紫薇科(Bignoniaceae)千张纸属(Oroxylum)，树高7m～12m的落叶高木植物。原产地为东南亚，印度及中国，在这些地域中自然生长于山的斜面或沿着溪流自然生长。千张纸的开花期为7～8月，种子在10～12月可采集。千张纸的种子为可在这些地域中得到的一般流通品。

应予说明，在东南亚等千张纸的果实、新叶、花苞等作为食用品被使用。此外，千张纸被视为具有药效，被使用于声音嘶哑或语言障碍的治疗、伤害的治疗(止血)、健胃、止咳等。

千张纸的种子除了胚芽，胚乳(endosperm)之外也具有翼状的薄膜(用于使种子飞散到远方的部位)，整体上成薄的片状体。

为了得到第1馏分所使用的千张纸的种子也可附带上述薄膜，也可除去上述薄膜。在本说明书及各附图中，千张纸的种子包含附带上述薄膜与除去上述薄膜的两者。

为了得到与实施方式1有关的透明质酸合成促进剂及HAS2mRNA表达促进剂，例如可使用将由千张纸采集的种子弄干使其自然干燥的干燥物。此外，也可使用千张纸的种子的无加工物、加热干燥物、冷冻干燥物、冷冻物等。

当进行提取时，例如可直接使用千张纸的种子，也可切碎使用，也可做成粉末状使用。

在本说明书中，“水性有机溶剂”是指以亲水性的有机溶剂为主成分的溶剂。“亲水性的有机溶剂”是指不与水分离而混合的有机溶剂。亲水性的有机溶剂可例示低级脂肪族醇(lower aliphatic alcohol)及丙酮。低级脂肪族醇可例示甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等的一元醇，或1，3-丁二醇、丙二醇、1，3-丙二醇、戊二醇、异戊二醇等的多元醇。

水性有机溶剂也可含有两种类以上的有机溶剂。

水性有机溶剂也可含有水。应予说明，当水性有机溶剂含有水时，亲水性的有机溶剂是否为主成分，要考虑去掉构成成分之中的水。也就是说，即使是水比亲水性的有机溶剂多的情形，若有机溶剂中的亲水性的有机溶剂为主成分，则为在本说明书中提到的“水性有机溶剂”。

当水性有机溶剂含有水时，水性有机溶剂优选含有30％以上的上述亲水性的有机溶剂，更优选含有50％以上。

作为第1馏分的具体例可举出由千张纸的种子通过使用水性有机溶剂的提取而得到的提取液，该提取液的稀释液或浓缩液，将该提取液干燥而得到的干燥物及它们的粗纯化物或纯化物。

应予说明，如后述的试验例所示，在由千张纸的种子使用水性有机溶剂而提取的馏分中包含有白杨素。因此，只要不进行像从提取液、浓缩液、稀释液、干燥物、粗精制物、精制物等除去白杨素那样的处理，就满足“包含白杨素”的条件。其与第2馏分～第4馏分也一样。

提取只要能将包含于千张纸的种子的可溶性的馏分溶出于水性有机溶剂，就未被特别限定，可依照常用方法进行。在提取时无需采用特殊的方法或装置，可采用任意的方法或装置。

作为提取的方法的例子可举出在常温提取的方法，或加热到水性有机溶剂的沸点以下的温度而提取的方法，在加热回流下提取的方法。此时，仅浸渍千张纸的种子也可以，与溶剂一起搅拌也可以。水性有机溶剂的量例如可为提取原料的5～50倍量(重量比)。提取时间例如可为1～72小时。提取温度例如可为室温～95℃。

在进行利用水性有机溶剂的提取前，也可进行使用戊烷、己烷、庚烷、辛烷、石油醚等的非极性溶剂的脱脂处理。

可通过在使可溶性的馏分溶出出后，进行过滤，离心分离等的处理去掉提取残渣得到提取液。为了由所得到的提取液得到该提取液的稀释液、浓缩液、干燥物、粗纯化物、纯化物等，也可依照常用方法更进一步进行稀释、浓缩、干燥、纯化等的处理。

作为第1馏分的纯化，也可进行以脱色，脱臭等为目的的纯化。该纯化可使用例如各种吸附处理或各种分离处理(例如使用活性炭、吸附树脂、离子交换树脂、硅胶、凝胶过滤材料的处理)。此点在后述的第2馏分～第4馏分中也一样。

[实施方式2]

与实施方式2有关的透明质酸合成促进剂及HAS2mRNA表达促进剂含有以水及乙酸乙酯对通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的第1馏分进行液-液分配时，被分配在所述乙酸乙酯侧的馏分中至少包含白杨素的第2馏分作为有效成分。

第1馏分可通过由上述实施方式1所记载的方法得到。

液-液分配只要可由第1馏分分离第2馏分就未被特别限定，可依照常用方法进行。液-液分配的实施无需采用特殊的方法或装置，可采用任意的方法或装置。

[实施方式3]

与实施方式3有关的透明质酸合成促进剂及HAS2mRNA表达促进剂含有以水及乙酸乙酯对通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的第1馏分进行液-液分配，通过90％甲醇及己烷进一步对被分配在所述乙酸乙酯侧的第2馏分进行液-液分配时，被分配在所述90％甲醇侧的馏分中至少包含白杨素的第3馏分作为有效成分。

第1馏分可通过上述实施方式1所记载的方法得到。第2馏分可通过上述实施方式2所记载的方法得到。

液-液分配只要可由第2馏分分离第3馏分就未被特别限定，可依照常用方法进行。液-液分配的实施无需采用特殊的方法或装置，可采用任意的方法或装置。

[实施方式4]

与实施方式4有关的透明质酸合成促进剂及HAS2mRNA表达促进剂含有以水及乙酸乙酯对通过水性有机溶剂从千张纸的种子所提取的第1馏分进行液-液分配，通过90％甲醇及己烷进一步对被分配在所述乙酸乙酯侧的第2馏分进行液-液分配，通过硅胶层析法对被分配在所述90％甲醇侧的第3馏分进行分馏时，通过氯仿：甲醇为9：1的混合溶剂由硅胶所溶出的馏分中至少包含白杨素的第4馏分作为有效成分。

第1馏分可通过上述实施方式1所记载的方法得到。第2馏分可通过上述实施方式2所记载的方法得到。第3馏分可通过上述实施方式3所记载的方法得到。

硅胶层析法只要可由第3馏分分离第4馏分就未被特别限定，可依照常用方法进行。进行硅胶层析法时无需采用特殊的方法或装置，可采用任意的方法或装置。

实施方式5

与实施方式5有关的透明质酸合成促进剂及HAS2mRNA表达促进剂含有白杨素作为有效成分。

白杨素是下列的式(1)所记载的化合物，

白杨素如后述的试验例所示，包含于上述的第1馏分～第4馏分。透明质酸合成促进剂及HAS2mRNA表达促进剂所使用的白杨素可从千张纸的种子得到(参照后述的试验例)，也可从千张纸的种子以外的天然产物，且含有白杨素的天然产物得到，也可为市售品或合成品。

在从千张纸的种子得到白杨素的情形下，例如可由实施方式4所记载的第4馏分单离。白杨素的单离·纯化可适合使用硅胶层析法及凝胶过滤层析法，但本发明不限于此。

硅胶层析法及凝胶过滤层析法只要可将白杨素单离·纯化就没有特别限定，可依照常用方法进行。进行硅胶层析法及凝胶过滤层析法时无需采用特殊的方法或装置，可采用任意的方法或装置。

与上述实施方式1～5有关的透明质酸合成促进剂及HAS2mRNA表达促进剂可透过其透明质酸合成促进作用及HAS2mRNA表达促进作用补充或增加生物体内的透明质酸的量，其结果，可期待皮肤的不正常或关节痛等的症状的预防，抑制及改善或正常化。但是，与本发明有关的透明质酸合成促进剂及HAS2mRNA表达促进剂除了这些用途以外，也能适用于对于发挥透明质酸合成促进作用及HAS2mRNA表达促进作用具有意义的所有的用途。

[实施方式6]

与实施方式6有关的医药品，食品或化妆料，含有上述实施方式1～5中任意实施方式所记载的透明质酸合成促进剂或HAS2mRNA表达促进剂。

当与实施方式6有关的医药品为内用医药品时，给药方法未特别限定，例如能以：口服给药、直肠内给药等的经肠给药；经鼻给药等的粘膜给药；静脉内给药、皮下给药等的注射给药。本发明的内用医药品的剂型能以适合给药方法的方式，例如能以：锭剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、粉末、丸剂、含片剂等的固体剂；溶液、悬浮液、乳剂、糖浆剂、注射剂等的液剂；凝胶状的制剂。作为与实施方式6有关的医药品，也可将实施方式1～5中任一实施方式所记载的透明质酸合成促进剂或HAS2mRNA表达促进剂的纯品、纯化物、粗纯化物等直接给药，也可与药理上被容许的赋形剂一起给药。作为赋形剂可使用单糖类、双糖类、多糖类、无机盐类、油脂、蒸馏水等作为制剂通常可使用的物质。将与实施方式6有关的内用医药品制剂化时，也可使用粘合剂、润滑剂、分散剂、悬浮剂、乳化剂、稀释剂、缓冲剂、抗氧化剂、抑菌剂等的添加剂。

当与实施方式6有关的医药品为外用医药品时，其形态未被特别限定，例如能以：软膏剂、膏剂、糊剂(cataplasm)、胶带剂、外用剂。与实施方式6有关的外用医药品，除了实施方式1～5中任一实施方式所记载的透明质酸合成促进剂或HAS2mRNA表达促进剂之外，也可根据需要含有其他的医药成分或赋形剂等。在制造与实施方式6有关的外用医药品时也可使用粘合剂、分散剂、悬浮剂、乳化剂、稀释剂、缓冲剂、抗氧化剂、抑菌剂等的添加剂。

与实施方式6有关的医药品可按照各种资料(例如内用医药品的话为给药方法、剂型，透明质酸合成促进剂或HAS2mRNA表达促进剂本身的有效给药量、作为制剂的有效给药量等的资料)设定最佳的透明质酸合成促进剂或HAS2mRNA表达促进剂的含量。

与实施方式6有关的食品的形态，例如可制成实施方式1～5中任一实施方式所记载的透明质酸合成促进剂或HAS2mRNA表达促进剂的纯品，部分纯化品，含有透明质酸合成促进剂或HAS2mRNA表达促进剂的浆糊(paste)，配合透明质酸合成促进剂或HAS2mRNA表达促进剂的一般食品。具体的形态可举出保健饮料、果冻、饼干、茶、锭剂、丸剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、散剂、细粒剂、颗粒剂，只要是可作为食品提供的形态则可使用任意形态。在制造与实施方式6有关的食品时，副原料也可使用赋形剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、悬浮剂、乳化剂、稀释剂、缓冲剂、抗氧化剂、抑菌剂等的添加剂。

与实施方式6有关的化妆料的形态例如可制成化妆水、美容液、乳液、乳霜、凝胶、面膜、美容粉饼、洗面乳、沐浴剂等，只要是可作为化妆料使用的形态，则可使用任意形态。与实施方式6有关的化妆料除了实施方式1～5中任一实施方式所记载的透明质酸合成促进剂或HAS2mRNA表达促进剂之外，也可根据需要含有配合于化妆料的各种配合成分。配合成分例如可使用固体油、半固体油、液体油、低分子保湿剂、高分子保湿剂、脂溶性保湿剂、润滑剂(emollient)、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、pH调节剂、乙醇、水。

与上述实施方式6有关的医药品、食品及化妆料可透过与实施方式1～5有关的透明质酸合成促进剂及HAS2mRNA表达促进剂所具有的透明质酸合成促进作用及HAS2mRNA表达促进作用补充或增加生物体内的透明质酸的量，其结果，可期待皮肤的不正常或关节痛等的症状的预防、抑制剂改善或正常化。但是，与实施方式6有关的医药品、食品及化妆料除了此用途以外，也能使用于对于发挥透明质酸合成促进作用及HAS2mRNA表达促进作用具有意义的所有的用途。

此外，虽然实施方式1～6所记载的透明质酸合成促进剂、HAS2mRNA表达促进剂、医药品、食品及化妆料对人类适合被适用，但只要可达成各作用效果，也能适用于人类以外的动物。

[试验例]

以下，作为试验例，举出“1.分划·单离第1馏分～第4馏分及白杨素的试验例”，“2.用于确认透明质酸合成促进作用的试验例”及“3.用于确认HAS2mRNA表达促进作用的试验例”从而更详细地说明本发明。应予说明，以下的试验例为表示对于分馏等的方法或作用确认的结果，本发明不受以下试验例的限制。

1.分划·单离第1馏分～第4馏分及白杨素的试验例

图2是用于说明试验例1～5中的试样a～e而显示的流程图。应予说明，由于试验例6中的试样f是与试样a～e不同系统的试样，因此图2未记载。

以下通过试验例1～试验例6对第1馏分～第4馏分及白杨素的分馏·单离进行说明。

应予说明，在以下的试验例中，水使用蒸馏水，甲醇、乙酸乙酯及己烷使用山一化学工业株式会社的日本生产一级的甲醇、乙酸乙酯及己烷。此外，实验器具使用一般品(例如100mL锥形瓶及30mL锥形瓶，岩城硝子株式会社的锥形瓶)。

[试验例1]

试验例1是用于得到通过水性有机溶剂从千张纸的种子提取的馏分中至少包含白杨素的第1馏分的试验例。如图2所示，以在试验例1被分划的第1馏分作为试样a。

在试验例1中使用甲醇作为水性有机溶剂。

首先，准备千张纸(Oroxylum indicum)的种子1kg。千张纸的种子使用一般流通品的干燥物(附有翼状的薄膜者)。

其次，以剪刀将千张纸的种子剪断并弄碎，将其浸在甲醇进行提取。提取在不锈钢制的容器中进行。提取方法以冷浸(室温，甲醇20L，提取时间24小时)，合计进行3次提取。

然后，在室温下进行自然过滤，得到提取液(荧光黄绿色的透明的液体)。进而对该提取液减压浓缩(40℃，60mmHg)，得到黑色的固体的试样a(第1馏分)31.2g。以千张纸的种子的重量(1kg)为基准的固体收率为3.12％。

应予说明，虽然不进行试样a是否包含白杨素的试验，但如后述的试验例5所示，因重复试样a的分馏·纯化的结果得到了白杨素，因此明确了试样a包含白杨素。此点在后述的试验例2～试验例4中的试样b～试样d也一样。

试验例2

试验例2是用于得到以水及乙酸乙酯对通过水性有机溶剂从千张纸的种子提取的第1馏分进行液-液分配时，被分配在乙酸乙酯侧的馏分且至少包含白杨素的第2馏分的试验例。以在试验例2被分馏的第2馏分作为试样b。

首先，将水800mL加到试验例1得到的试样a(第1馏分)31.2g作为悬浮液，对该悬浮液合计进行3次利用乙酸乙酯的提取(室温，乙酸乙酯100mL)。提取使用分液漏斗进行。

然后回收乙酸乙酯，进行减压浓缩(40℃，75mmHg)，得到黑色的固体的试样b(第2馏分)11.8g。以千张纸的种子的重量为基准的固体收率为1.18％。

试验例3

试验例3是用于得到以水及乙酸乙酯对通过水性有机溶剂从千张纸的种子提取的第1馏分进行液-液分配，通过90％甲醇及己烷进一步对被分配于乙酸乙酯侧的第2馏分进行液-液分配时，被分配在90％甲醇侧的馏分，且至少包含白杨素的第3馏分的试验例。以在试验例3被分割的第3馏分作为试样c。

首先，将90％甲醇300mL加到在试验例2得到的试样b(第2馏分)11.8g作为悬浮液，对该悬浮液合计进行3次利用己烷的提取(室温，己烷300mL)。提取使用分液漏斗进行。

然后回收90％甲醇，进行减压浓缩(40℃，75mmHg)，得到黑色的固体的试样c(第3馏分)4.0g。以千张纸的种子的重量为基准的固体收率为0.40％。

试验例4

试验例4是用于得到以水及乙酸乙酯对通过水性有机溶剂从千张纸的种子提取的第1馏分进行液-液分配，通过90％甲醇及己烷进一步对被分配在乙酸乙酯侧的第2馏分进行液-液分配，通过硅胶层析法对被分配在90％甲醇侧的第3馏分进行分馏时，通过氯仿：甲醇为9：1的混合溶剂由硅胶溶出的馏分，且至少包含白杨素的第4馏分的试验例。以在试验例4被分划的第4馏分作为试样d。

首先，以少量(数十mL左右)的氯仿及甲醇的混合溶剂使在试验例3得到的试样c(第3馏分)4.0g溶解作为溶液。其次，将该溶液放在填充了硅胶(和光纯药株式会社的Wakosil C-200)的柱

然后，通过氯仿：甲醇＝9：1的混合溶剂300mL进行溶出，得到组分A-1。然后，通过氯仿：甲醇＝4：1的混合溶剂300mL，氯仿：甲醇＝1：1的混合溶剂300mL，甲醇300mL依次进行溶出，依次得到组分A-2，组分A-3，组分A-4。

其中对组分A-1进行减压浓缩(40℃，60mmHg)，得到咖啡色～黑绿色提取物状的试样d(第4馏分)2.32g。以千张纸的种子的重量为基准的固体收率为0.232％。

[试验例5]

试验例5是用于得到白杨素的试验例。以在试验例5被单离的白杨素作为试样e。

应予说明，在试验例5中的硅胶层析法及凝胶过滤层析法中，由各fraction采取少量(20～30mL左右)的样品，以TCL确认点。通过对颜色或UV灯的反应而确认点。对于点的样子相同的fraction，作为一个组分进行处理。每一个fraction的溶液的量不一定，也有一边观察溶液的颜色等一边分fraction的情况。

首先，以少量的氯仿及甲醇的混合溶剂使在试验例4得到的试样d(第4馏分)中由后半的fraction得到的份的2.27g溶解作为溶液。其次，将该溶液放在填充了硅胶(和光纯药株式会社的Wakosil C-200)的柱

接着，通过氯仿：甲醇＝9：1的混合溶剂500mL进行溶出，由前半的3fraction得到组分B-1，由后半的2fraction得到组分B-2。然后，通过甲醇300mL进行溶出，得到组分B-3。

其中对组分B-1进行减压浓缩(40℃，60mmHg)，得到来自组分B-1的馏分1.04g。

进而，以少量的氯仿及甲醇的混合溶剂使来自组分B-1的馏分1.04g溶解作为溶液。其次，将该溶液放在填充了硅胶(和光纯药株式会社的Wakosil C-200)的柱

接着，通过氯仿500mL进行溶出，由前半的1fraction得到组分C-1，由后半的3fraction得到组分C-2。然后，通过氯仿：甲醇＝19：1的混合溶剂300mL，甲醇300mL依次进行溶出，依次得到组分C-3，组分C-4。其中对组分C-2进行减压浓缩(40℃，60mmHg)，得到来自组分C-2的馏分0.35g。

进而，以少量的氯仿及甲醇的混合溶剂使来自组分C-2的馏分0.35g溶解作为溶液。其次，将该溶液放在填充了硅胶(和光纯药株式会社的Wakosil C-200)的柱

接着，通过氯仿500mL进行溶出，由前半的1fraction得到组分D-1，由后半的3fraction得到组分D-2。然后，通过甲醇300mL进行溶出，得到组分D-3。

其中对组分D-2进行减压浓缩(40℃，60mmHg)，得到来自组分D-2的馏分0.31g。

进而，以少量的氯仿及甲醇的混合溶剂使来自组分D-2的馏分0.31g溶解作为溶液。其次，将该溶液放在填充了层析用的凝胶过滤材料(Sigma-Aldrich公司的SephadexLH-20)的柱

接着，通过氯仿：甲醇＝1：1的混合溶剂500mL进行溶出，由最初的2fraction得到组分E-1，由下一个1fraction得到组分E-2，由再下一个1fraction得到组分E-3。

其中对组分E-3进行减压浓缩(40℃，60mmHg)，得到来自组分E-3的馏分0.07g。

进而，以少量的氯仿及甲醇的混合溶剂使来自组分E-3的馏分0.07g溶解作为溶液。其次，将该溶液放在填充了层析用的凝胶过滤材料(Sigma-Aldrich公司的SephadexLH-20)的柱

接着，通过氯仿：甲醇＝1：1的混合溶剂500mL进行溶出，由最初的1fraction得到组分F-1，由下一个3fraction得到组分F-2，由再下一个1fraction得到组分F-3。

其中对组分F-2进行减压浓缩(40℃，60mmHg)，得到试样e(白杨素)约10mg。以千张纸的种子的重量为基准的固体收率为约0.001％。

对于向上述那样被单离的试样e(白杨素)通过核磁共振光谱法取得1H-NMR光谱资料。该资料的取得使用了JEOL RESONANCE株式会社的JNM-ECA500。

其结果观测到以下的峰(以概略值，只记载主要的峰)，与一般已知的白杨素的1H-NMR光谱资料大致一致。

1H-NMR(acetone-d₆)：δ(ppm)＝6.29(1H，d，J＝1.7Hz，H-6)、6.58(1H，d，J＝1.7Hz，H-8)、6.79(1H，s，H-3)、7.60(2H，m，H-3’，H-5’)、7.61(1H，m，H-4’)、8.07(2H，dd，J＝8.1，1.7Hz，H-2’，H-6’)

而且，对于试样e进行了利用高效液相色谱法的分析。该分析使用了岛津制作所株式会社的二极体阵列检测器SPD-M20A，供给单元LC-20AB，柱烘箱CTO-20A及资生堂株式会社的HPLC柱CAPCELL PAK MG II 4.6mm I.D.×250mm。在分析中，A液为磷酸盐缓冲剂(pH6.5)，B液为100％甲醇，直线梯度以A：B＝95：5～20：80(60分)，柱温为40℃。检测方法使用二极体阵列(190-800nm)。

首先，对于白杨素标准品(购自东京化成工业株式会社)以上述的条件进行分析，确认了在53.7分产生最大的峰。其次，对于试样e以相同的条件进行分析，确认了在52.6分产生最大的峰。而且，确认了白杨素标准品及试样e的最大峰的光谱一致。

如上所述，通过核磁共振光谱法及高效液相色谱法可确认了试样e主要由白杨素构成。

此外，由于试样e是由试样a～d分馏·单离的物质，因此可确认试样a～d也包含白杨素。

[试验例6]

试验例6是用于得到通过水性有机溶剂从千张纸的种子提取的馏分中至少包含白杨素的第1馏分的另一试验例。以在试验例6被分馏的第1馏分作为试样f。

在试验例6中使用50％乙醇作为水性有机溶剂。

首先，准备千张纸(Oroxylum indicum)的种子10kg。千张纸的种子使用一般流通品的干燥物(附有翼状的薄膜)。

其次，将千张纸的种子切碎，将其浸在50％乙醇进行提取。提取方法以在加热回流下的提取(80℃，50％乙醇150L，提取时间2小时)。

然后，在室温下进行自然过滤得到提取液，进而对该提取液减压浓缩(加温，但是60℃以下)，得到试验f(第1馏分)。

2.用于确认透明质酸合成促进作用的试验例

[试验例7]

试验例7是用于确认对于本发明中的第1馏分，第3馏分，第4馏分及白杨素的透明质酸合成促进作用的试验例，进行透明质酸合成促进作用的测定。

首先对试验方法进行说明

作为播种·传代用培养基使用含有10％(V/V)胎牛血清(FBS，购自NICHIREI生物科学株式会社，CCB公司)最低必须培养基α(MEMα、购自GIBCO、Cat.No.11900-024)。使用该培养基，将人类新生儿皮肤纤维母细胞(NB1RGB、购自理研生物资源中心(Riken BioResourceCenter)、Resource.No.RBRC-RCB022)播种于96孔培养板以成为2×10⁴cells/well。确认在24小时后细胞粘着，为了除去培养基中的血清以无FBS的最低必须培养基α进行两次清洗。然后，将化验用的培养基的含有0.5％(V/V)胎牛血清最低必须培养基α添加到全部孔，以成为100μL/well。然后，添加100μL/well的包含各种试样的培养基(以化验用的培养基进行制备，以成为终浓度的倍的浓度)及不包含试样的培养基(对照用)，更进一步进行72小时培养。

培养结束后，对培养上清使用ELISA测定套件的Quantikine ELISA HyaluronanImmunoassay(R&D Systems公司)及吸光微盘分析仪的Multiskan Spectrum(ThermoFisher Scientific株式会社(Thermo Fisher Scientific K.K.))，测定透明质酸量。而且，通过中性红法测定细胞生存率。设定以细胞生存率80％为大致的标准，以试样的浓度不更进一步给予细胞生存率影响的范围进行评价。通过ELISA法进行的透明质酸量的测定及通过中性红法进行的细胞生存率的测定因各自按照测定套件或机器的使用方法通过常用方法进行，因此省略详细的说明。

作为试样，分别使用试验例6的试样f作为第1馏分，使用试验例3的试样c作为第3馏分，使用试验例4的试样d作为第4馏分，使用试验例5的试样e作为白杨素。

其次，对试验结果进行说明

表1是表示试验例7的结果(各试样所产生的透明质酸合成促进作用)的表。此外，在表1中“浓度”是表示培养时的各试样的浓度，单位为μg/mL。而且，“活性量”是以对照中的透明质酸产生量为100的情形的透明质酸产生量，单位为％。进而，“细胞生存率”是以对照中的细胞生存率为100的情形的细胞生存率，单位为％。

[表1]

各试样所产生的透明质酸合成促进作用

如表1所示，对于本发明中的第1馏分，第3馏分，第4馏分及白杨素，可确认对人类新生儿皮肤纤维母细胞显示透明质酸合成促进作用。而且，在试验例7使用的试样中，可确认试样c(第3馏分)及试样e(白杨素)显示高的透明质酸合成促进作用的倾向。

此外，虽然在试验例7中未进行关于第2馏分的试验，但因对于其他的馏分及白杨素的全部可确认透明质酸合成促进作用，因此可考虑为第2馏分也当然具有透明质酸合成促进作用。

3.用于确认HAS2mRNA表达促进作用的试验例

试验例8

试验例8是对于本发明中的第1馏分及白杨素用于确认HAS2mRNA表达促进作用的试验例，进行了HAS2mRNA表达促进作用的测定。

首先对试验方法进行说明。

播种·传代用培养基及化验用的培养基为使用与上述试验例7一样。使用播种·传代用培养基，将人类新生儿皮肤纤维母细胞(与上述试验例7一样)播种于12孔培养板以成为1×10⁵cells/well，在24小时后以1×PBS(-)溶液进行一次清洗。然后，将化验用的培养基添加于全部孔，以成为700μL/well。然后，添加700μL/well的包含各种试样的培养基(以化验用的培养基进行制备，以成为终浓度的倍的浓度)及不包含试样的培养基(对照用)。培养时间是对于同一试样分成4，8，12，16，20，24小时的6阶段而进行。培养结束后，清除各孔的上清，以1×PBS(-)溶液1mL进行清洗。

对于RNA的提取，使用totalRNA纯化套件的NucleoSpinRNA(宝生物株式会社(TAKARABIO INC.))而进行。

在以1×PBS(-)溶液的清洗后，将Buffer RA1(totalRNA纯化套件的细胞溶解缓冲液)与2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)的混合试药加到各孔。Buffer RA1及2-巯基乙醇的量是以每2孔350μL及3.5μL。自各孔回收混合试药，移至样品分别管(RNA用的灭菌1.5mL管)，每管施以漩涡混合器(vortex mixer)并搅拌。从管的内容物使用纯化套件纯化totalRNA，在-80℃保管。因RNA的提取按照纯化套件的操作流程通过常用方法进行，因此省略详细说明。

对于像这样提取的totalRNA，使用SmartSpec Plus分光光度计(Bio-Rad公司)，由吸光度(260nm)测定RNA浓度。逆转录反应使用PrimeScript RT Master Mix(Perfect RealTime)(宝生物株式会社)，通过热块在37℃培养15分钟，在85℃培养5秒钟500ng的totalRNA，得到cDNA10μL。然后将各基因的正向及反向引物(10μM)各1μL，SYBR Premix EXTaqⅡ(宝生物株式会社)12.5μ，作为平衡的RNase Free H₂O加到所制备的cDNA2μL，总量为251μL。使用5'-GACAGGCATCTCACGAACCG-3'作为HAS2的正向引物，5'-CAACGGGTCTGCTGGTTTAGC-3'作为反向引物。内部标准使用glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)。Thermal>

而且，在试验例8中也通过与试验例7一样的方法进行细胞生存率的测定。

试样只使用试验例6的试样f作为第1馏分，使用试验例5的试样e作为白杨素。

其次，对试验结果进行说明。

表2是表示试验例8的结果(各试样所产生的HAS2mRNA表达促进作用)的表。此外，在表2中“浓度”是表示培养时的各试样的浓度，单位为μg/mL。而且，“促进率”是以对照中的HAS2mRNA表达量为1时的HAS2mRNA表达量的倍率，单位为倍。此外，包含试样的培养基的培养时间分成4～14小时的6阶段已于上述，在表2中记载关于促进率最大的培养时间的结果。促进率的数值之后以括弧表示者为培养时间。“细胞生存率”是以对照中的细胞生存率为100的情形的细胞生存率，单位为％。

[表2]

各试样所产生的HAS2mRNA表达促进作用

如表2所示，对于本发明中的第1馏分及白杨素，确认了对人类新生儿皮肤纤维母细胞显示HAS2mRNA表达促进作用，因此可考虑第2馏分～第4馏分也当然具有HAS2mRNA表达促进作用。

实施例

实施例1.软膏的制作

使用依照上述的试验例1所记载的方法制备的第1馏分，通过以下的处方以常用方法制作软膏(100g)。

(油相成分)

(水相成分)

(制备法)

将油相成分及水相成分分别加热到80℃并使其均匀，通过一边搅拌一边将水相加到油相，乳化后冷却制作了软膏。

实施例2.胶带剂的制作

使用依照上述的试验例2所记载的方法制备的第2馏分，通过以下的处方以常用方法制作胶带剂(100g)。

(粘着剂溶剂)

(药效成分)

第2馏分 0.01g

乙醇7.99g

(经皮吸收促进剂)

油醇0.80g

全体的量100g

(制备法)

分别使粘着剂溶剂及药效成分均匀，将药效成分及经皮吸收促进剂加到粘着剂溶剂，在室温下搅拌制作组合物。将该组合物延展于进行了硅处理的聚酯膜上，在120℃下干燥冷却后，使粘着剂层转印到聚乙烯膜，制作胶带剂。

实施例3.化妆水的制作

使用依照上述的试验例3所记载的方法制备的第3馏分，通过以下的处方以常用方法制作化妆水(100g)。

(油相成分)

聚氧乙烯(60摩尔)氢化蓖麻油 1.0g

鲨烷 0.05g

(水相成分)

(制备法)

分别使油相成分及水相成分均匀溶解。将油相加热，一边搅拌一边加到水相的一组分而进行制备，将该制备液加到剩下的水相，制作化妆水。

实施例4.乳液的制作

使用依照上述的试验例4所记载的方法制备的第4馏分，通过以下的处方以常用方法制作乳液(100g)。

(制备法)

将上述原料搅拌、混合而制作乳液。

实施例5.美容液的制作

使用依照上述的试验例5所记载的方法制备的白杨素，通过以下的处方以常用方法制作美容液(100g)。

(制备法)

将上述原料搅拌、混合、溶解而制作美容液。

实施例6.锭剂的制作

使用依照上述的试验例6所记载的方法制备的第1馏分，通过以下的处方制作锭剂(每一锭500mg)。

(制备法)

将第1馏分(2g)、干燥玉米淀粉(2g)、滑石(1.8g)、硬脂酸钙(0.2g)添加于乳糖(94g)并进行混合。然后，使用单冲打锭机(single stroke tablet press)并以常用方法制造锭剂。

实施例7.硬胶囊剂的制作

使用依照上述的试验例6所记载的方法制备的第1馏分，通过以下的处方制作硬胶囊剂(每一胶囊360mg)。

(制备法)

将乳糖(220g)及玉米淀粉(110g)添加于第1馏分(5g)并进行混合，将羟丙基纤维素(25g)的水溶液添加于其中并进行捏合(kneading)。然后，使用挤压造粒机通过常用方法制造颗粒。通过将该颗粒填充到明胶硬胶囊(gelatin hard capsule)制作硬胶囊剂。

实施例8.软胶囊剂的制作

使用依照上述的试验例6所记载的方法制备第1馏分，通过以下的处方制作软胶囊剂(每一胶囊170mg)。

第1馏分5mg

大豆油 165mg

(制备法)

将第1馏分(5g)添加于大豆油(165g)并进行混合。然后，通过使用旋转自动成型机依照常用方法填充到软胶囊制作软胶囊剂。

实施例9.丸剂的制作

使用依照上述的试验例6所记载的方法制备的第1馏分，通过以下的处方制作丸剂(每一粒100mg)。

(制备法)

以上述配合混合原料，适量加水后，以捏合机制造均质的捏合物，将得到的捏合物压延，使用制丸机制丸后进行干燥制作丸剂。

实施例10.果冻的制作

使用依照上述的试验例6所记载的方法制备的第1馏分，通过以下的厨房以常用方法制作果冻(100g)。

(制备法)

混合上述成分，加热到90℃。在确认明胶的溶解后填充到容器，进行冷却。通过使明胶固化而制作果冻。