猪细胞因子SYBR Green实时PCR检测方法的建立

摘要

目的:建立一种用SYBR Green荧光染料检测猪细胞因子的实时PCR方法.方法:从猪外周血淋巴细胞中提取细胞因子mRNA,反转录成cDNA,利用SYBR Green荧光染料法实时检测IL8、IL10、IFNα、IFNγ和TNFα的mRNA表达水平.分别通过融解曲线和琼脂糖凝胶电泳分析各细胞因子检测的特异性;并对各细胞因子PCR产物进行梯度稀释后作为模板进行敏感性试验;利用建立的方法分别对正常猪和感染PRRSV的猪的外周血淋巴细胞中上述细胞因子进行检测,并以管家基因cyclophilin为内参照对各细胞因子进行定量分析.结果:建立的各细胞因子SYBR Green实时检测方法具有良好的特异性和敏感性,TNFα检测敏感性可达10个拷贝,其它细胞因子检测敏感性均可达100个拷贝.猪在感染PRRSV后,外周血淋巴细胞中IL8和IL10明显增加,而IFNα和TNFα略有下降.结论:建立了五种猪细胞因子SYBR Green实时PCR检测方法,并能成功地应用于临床检测.