猪伪狂犬病毒、细小病毒和圆环病毒2型多重SYBR GreenⅠ实时PCR检测方法的建立

摘要

猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)是引起母猪繁殖障碍的3种主要病原体；猪伪狂犬病毒可引起家畜以及多种野生动物发热、奇痒和急性脑脊髓炎等神经症状，妊娠母猪流产、产死胎或木乃伊胎；猪细小病毒感染可引起母猪流产、不孕，胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化等，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻；猪圆环病毒2型可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，母猪繁殖障碍，皮炎及肾病综合征、肠炎等。　　 目前，针对以上3种病毒病的诊断方法有很多，这些方法具有操作复杂、费时费力、敏感度差及阴性率高等缺点；临床已经使用的PCR诊断技术，虽然有灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点，但不能准确定量；基于TaqMan技术荧光定量PCR方法能定量，但是成本较高，且需要合成特异性探针。亟需研究和开发简便、快速、特异、成本低、定量的检测方法。SYBR Green是非特异性结合于双链DNA的荧光染料，可以和多种扩增序列结合。在此基础上建立的SYBR Green real-time PCR与TaqMan荧光定量PCR相比，可能由于检测到非特异性的荧光信号；但可以通过溶解曲线分析来简单、直接扩增产物的特异性。SYBR Green real-time PCR可以不用设计和合成特异的荧光标记的探针直接扩增检测任何基因的技术。为此，做了以下研究：　　 （一）利用PCR技术扩增出猪伪狂犬病毒gH基因中187bp的片段，并克隆到pGEMT载体上，纯化的质粒作为PCR检测的标准模板，以10倍梯度稀释质粒为标准模板，进行SYBRGreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线，建立了猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达126拷贝/μl，与猪圆环病毒，猪细小病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪瘟病毒不发生交叉反应，具有良好的特异性和重复性；对15份疑似病料进行了检测，发现均为荧光定量PCR阳性，而常规PCR只能检测出6份阳性。结果表明：建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于临床PRV感染的检测。　　 （二）利用PCR技术扩增出猪细小病毒VP2保守区基因194bp片段，并克隆到pGEMT载体上，纯化后以10倍梯度稀释的质粒作为PCR检测的标准模板，进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线，建立了猪细小病毒的荧光定量PCR检测方法。灵敏度可达100拷贝/μl，与猪圆环病毒，猪繁殖与呼吸综合症病毒，猪乙型脑炎病毒，猪伪狂犬病毒，猪瘟病毒和猪流感病毒不发生交叉反应，具有良好的特异性和重复性；对10份疑似病料进行了检测，均为阳性，而常规PCR只检测出7份阳性。结果表明：建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于临床PPV感染的检测。　　 （三）根据已报道的猪圆环病毒2型ORF2基因组序列，设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增猪圆环病毒2型ORF2中一段保守序列，经克隆后转化到DH5α中。提取重组质粒，经PCR及测序鉴定后，作为阳性模板建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR标准曲线，并做灵敏性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明：标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，溶解曲线特异，相关系数为0.9988，灵敏度为35拷贝/μl，特异性和重复性较好。试验建立了检测猪圆环病毒2型的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，为该病的早期诊断，并定量分析猪圆环病毒感染程度奠定了基础。　　 （四）利用已报道的猪伪狂犬病毒的gH基因序列和猪细小病毒非结构蛋白NS1序列保守区域，分别设计并合成1对引物，通过常规PCR扩增，经克隆后转化到DH5α中。以纯化后的重组质粒作为模板建立了能够同时检测猪伪狂犬病毒和猪细小病毒的SYBRGreenⅠ实时荧光PCR技术。通过对该方法的灵敏度、特异性和重复性分析发现，能最少检测160拷贝猪伪狂犬病毒质粒和248拷贝猪细小病毒质粒；不能检测出猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪乙型脑炎病毒。试验表明：所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR技术能够同时检测这2种病毒，为快速诊断这2种疾病提供技术支持。　　 （五）利用已报道的猪伪狂犬病毒的gH基因序列和猪圆环病毒2型ORF2基因组序列，分别设计并合成1对引物，通过常规PCR扩增，经克隆后转化到DH5α中。以纯化后的重组质粒作为模板建立了能够同时检测猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR技术。通过对该方法的灵敏度、特异性和重复性分析发现，能最少检测180拷贝猪伪狂犬病毒质粒和215拷贝猪圆环病毒2型质粒；不能检测出猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪乙型脑炎病毒。试验表明：所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR技术能够有效诊断和检测这2种病毒，有利于这2种疾病的早期鉴别诊断。　　 （六）根据已报道的猪细小病毒VP2保守区基因序列和猪圆环病毒2型ORF2基因组序列，分别设计并合成1对引物，通过常规PCR扩增，经克隆后转化到DH5α中。以纯化后的重组质粒作为模板建立了能够同时检测猪细小病毒和猪圆环病毒2型的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR技术。通过对该方法的灵敏度、特异性和重复性分析发现，该方法能最少检测175拷贝猪细小病毒质粒和156拷贝猪圆环病毒2型质粒；不能检测出非特异的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪乙型脑炎病毒。试验表明：此方法能够有效诊断和检测这2种病毒，也为这2种疾病的治疗提供了技术检测手段。　　 （七）利用已报道的猪细小病毒VP2保守区基因序列、猪圆环病毒2型ORF2基因组序列和猪伪狂犬病毒的gH基因序列，分别设计并合成1对引物，通过常规PCR扩增，经克隆后转化到DH5α中。以纯化后的重组质粒作为模板建立了能够同时检测猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒多重SYBR GreenⅠ实时荧光PCR技术。通过对所建立的PCR方法的灵敏度、特异性和重复性分析发现，该方法能最少检测189拷贝猪伪狂犬病毒质粒、203拷贝猪细小病毒质粒和173拷贝猪圆环病毒2型质粒；不能检测出非特异的猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪乙型脑炎病毒。试验表明：所建立的多重SYBR GreenⅠ实时荧光PCR技术能够有效诊断和检测这3种病毒，也为这3种疾病的免疫程序修订提供依据。