SPR生物传感器研究缺乏3′→5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶对DNA的分子识别功能

摘要

Taq聚合酶(Taq pol)、失去核酸酶结构域的鼠白血病逆转录酶(MMLV RT-)和人源的聚合酶β(polβ)缺少3′→5′外切核酸酶活性.利用表面等离子激元共振(SPR)生物传感器,研究了Taqpol与引物末端完全匹配和含有1、2、3个错配碱基的DNA模板-引物(T-P)的结合动力学,并分析比较了在"正确"或"错误"dNMP环境中Taq pol和引物末端完全匹配的DNA T-P的结合.实验结果表明,随着引物末端错配碱基逐个增加,Taq pol和DNA的结合亲和力呈下降趋势,说明增强和引物末端完全匹配的DNA T-P的亲和力是Taqpol选择正确配对碱基的途径之一.在"错误"的dNMP环境中,Taq pol与DNA T-P的结合动力学能够用简单的1:1 Langmuir模型进行拟合,但是MMLV RT-与DNA T-P的结合动力学可能存在构象变化.而在"正确"的dNMP环境中,Taq pol或MMLV RT-与DNA T-P的结合符合构象变化模型,而且亲和力常数分别是无dNMP时的20倍和64倍,说明"正确"的dNMP诱导酶(Taq pol或MMLVRT-)-DNA复合物发生构象变化,大大增强了酶-DNA复合物结合的紧密程度.在存在大量dNMP的环境中,pol β与DNA T-P的结合动力学明显与缺乏dNMP时相异,pol β和DNA的亲和力显著增强.