抗凝血酶基因T98I和A404T突变导致抗凝血酶缺陷症的分子机制研究

摘要

目的 研究抗凝血酶(AT)基因T98I和A404T突变致AT缺陷症的分子机制.方法 构建AT野生型和突变体表达质粒(ATwt、AT T98I、AT A404T)并瞬时转染至COS-7细胞或CHO细胞,进行体外表达试验、脉冲-追踪试验和细胞免疫荧光染色;用荧光实时PCR(RT-PCR)检测转染细胞AT mRNA表达量的改变;蛋白降解抑制实验检测突变蛋白在细胞内的降解途径.结果 AT T98I未从转染细胞内分泌且在细胞内逐渐降解,AT A404T仅部分从细胞内分泌、大部分未分泌并在细胞内逐渐降解.RT-PCR显示,与野生型AT mRNA相比,突变体AT mRNA不降低.脉冲-追踪试验发现,这两种AT突变体分泌障碍,未在细胞内聚集而是降解.蛋白降解抑制实验显示,突变体AT T98I通过蛋白体酶途径进行细胞内降解.转染细胞荧光染色显示,转染AT T98I质粒的CHO细胞内荧光强度明显减弱、无明显核周聚集,而转染AT A404T质粒的CHO细胞内荧光减弱且弥散分布于胞质、核周有轻度聚集.结论 分泌障碍和细胞内降解是AT基因T98I和A404T突变导致AT缺陷症的分子病理机制.