虎奶菇多功能过氧化物酶的基因克隆和表达分析

摘要

根据白腐菌多功能过氧化物酶(Versatile peroxidase,VPs)基因序列的保守区域设计引物,利用简并PCR、cDNA末端的快速扩增(RACE)和融合引物巢式结合PCR(FPNI-PCR)等方法,扩增得到虎奶菇多功能过氧化物酶基因(GenBank登录号MN701764),命名为Pt-vp1.该基因DNA全长1833bp,含有15个外显子和14个内含子,cDNA和完整开放阅读框1077bp,编码358个氨基酸.多种白腐菌VPs氨基酸序列的系统发育结果表明,Pt-vp1蛋白与平菇VP(GenBank登录号ASU87523.1)亲缘关系最近.在发酵培养基中静止培养4d后虎奶菇VP达到最大酶活,为43.83 U/L.在发酵培养基中加入不同浓度Mn2+,当其浓度为200 μmol/L时,虎奶菇VP酶活达到最大值,为91.98 U/L,表明Mn2+不是虎奶菇产生VP的必要因子,但可以显著提高产酶量.利用实时荧光定量qRT-PCR技术检测不同浓度Mn2+对Pt-vp1基因转录水平的影响,结果显示Mn2+对Pt-vp1蛋白的表达具有促进作用,当Mn2+浓度为300 μmol/L时,其转录水平增加了5.79倍.本研究结果为研究虎奶菇VP基因的表达机制及功能研究提供了重要信息.