白腐真菌多功能过氧化物酶基因克隆表达研究

摘要

白腐真菌对木质素的有效降解主要依赖于一系列木质素降解酶系，其中多功能过氧化物酶Versatile peroxidase（VP）是一类含亚铁血红素的过氧化物酶，它兼具木质素过氧化物酶Lignin peroxidase（LiP）和锰过氧化物酶Manganese peroxidase（MnP）两者的特性，在木质纤维素生物预处理、染料脱色、污染物降解转化等方面具有很大的应用价值和潜能。因此，发掘多功能过氧化物酶基因资源、构建高效表达体系及探索其表达调控规律，有助于深入揭示白腐菌降解木质素的机制及其应用研究。基于此，本论文对白腐真菌Physisporinus sp.P18的多功能过氧化物酶基因进行克隆，异源及诱导表达研究，获得主要结论如下：
　　对本实验室的P18菌株进行分子生物学属性鉴定，将其归为亚卧孔菌属，命名为Physisporinus sp.P18。并对其产酶规律进行研究，发现Mn2+可促进Physisporinus sp.P18胞外VP等Mn2+依赖过氧化物酶酶活水平，0~1mM的范围内，M n2+浓度越高，促进作用越明显。
　　进一步采用简并PCR和基因组步移技术获取了VP1和VP2全长序列，并进行了生物信息学分析。其中VP1和VP2全长结构基因分别为1669bp和1651bp，去除内含子后的编码序列长1077bp，编码358个氨基酸（两者同源性88％）；预测编码的多功能过氧化物酶含有21个氨基酸长度的信号肽，去除信号肽的成熟蛋白分子量分别为36.83KD和35.79KD，等电点分别为4.54和4.35。
　　通过荧光定量PCR的方法研究了Mn2+对Physisporinus sp.P18多功能过氧化物酶基因转录水平的促进作用，初步探索了Mn2+对多功能过氧化物酶的表达影响规律。150~500μM的低浓度范围内，Mn2+对Physispo rinus sp.P18VP1~3转录水平有显著促进作用，但对不同VP基因的最佳促进浓度不相同，分别在150、300、500μM的浓度下对VP1~3有4.0、3.5、3.8倍的最佳促进作用；当M n2+增加到1000、1500μM的高浓度时，对VP3仍分别有2.3和3.7倍的显著促进作用。
　　构建了Physisporinus sp.P18-rVP1基因表达载体并在大肠杆菌中表达，通过对重组蛋白包涵体的复性重折叠获取活性蛋白，再经镍柱分离，最终纯化酶蛋白rVP1得率为18mg/L，比酶活为23.1U/mg，研究其酶学性质结果显示：重组多功能过氧化物酶rVP1以M n2+为底物时，最适反应pH为5.0，最适反应温度为40°C；M n2+可影响rVP1对其他底物的动力学常数；rVP1对中性和碱性环境、多数金属离子以及对酶抑制剂中的SDS耐受性较好。在pH5.0和Mn2+存在时，rVP1对5种不同结构类型的染料均有较强脱色作用，并能有效催化工业碱木素和天然木质素EMAL。
　　综上所述，本论文获取了白腐真菌Physisporinus sp.P18多功能过氧化物酶基因资源，初步研究了Mn2+对多功能过氧化物酶转录表达的诱导作用，构建了大肠杆菌表达体系并成功获得具有活性的重组多功能过氧化物酶蛋白rVP1，对rVP1的性质功能进行了研究。本论文为Physisporinus sp.P18多功能过氧化物酶结构功能深入研究奠定了基础，也为揭示其表达调控及木质素降解分子机制提供了研究基础。

目录

声明

英文缩略表

1 绪论

1. 1 白腐真菌及其木质素降解酶

1. 2 多功能过氧化物酶

1. 3 多功能过氧化物酶分子生物学研究进展

1. 4 论文研究内容

2 Physisporinus sp. P18菌株生物学属性及产酶规律研究

2. 1 实验材料

2. 2 实验方法

2. 3 结果与分析

2. 4 本章小结

3 Physisporinus sp. P18多功能过氧化物酶基因的克隆

3. 1 实验材料

3. 2 实验方法

3. 3 结果与分析

3. 4 本章小结

4 Mn2+对Physisporinus sp. P18 VP1~3基因转录影响研究

4. 1 实验材料

4. 2 实验方法

4. 3 结果与分析

4. 4 本章小结

5 Physisporinus sp. P18多功能过氧化物酶VP1异源表达

5. 1 实验材料

5. 2 实验方法

5. 3 结果与分析

5. 4 本章小结

6 结论与展望

6. 1 结论

6. 2 展望

致谢

参考文献

附录 攻读硕士学位期间发表论文