带FLAG标签的CDK4真核表达载体构建及对喉癌细胞的影响

摘要

目的 构建带Flag标签的pcDNA3.0载体细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase,CDK4)的真核表达载体,验证该基因对喉癌Hep-2细胞增殖的影响.方法 以人乳腺文库为模板采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出CDK4的CDS区编码序列,应用双酶切将带Flag标签pcDNA3.0载体插入到PCR产物上,转化DH5α提取质粒,测序正确后转染喉癌Hep-2细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CDK4基因的转录水平,蛋白质印迹鉴定目的基因蛋白表达,CCK-8法和克隆形成实验测定其对喉癌Hep-2细胞生长的影响.结果 pcDNA3.0-Flag-CDK4真核表达载体构建成功;提取质粒转染Hep-2细胞,qRT-PCR技术检测到该基因在Hep-2中转录水平明显增高;蛋白质印迹实验验证该基因蛋白成功表达;CCK-8法和克隆形成实验证明CDK4基因可促进Hep-2细胞增殖.结论 pcDNA3.0-Flag-CDK4真核表达载体构建成功并验证该基因促进喉癌细胞增殖,为进一步研究该基因在喉癌中的发生发展奠定了前期基础.