FLAG-HA-Bad双标签真核表达载体的构建及Bad相互作用蛋白质筛选的串联亲和纯化技术研究

摘要

细胞凋亡是一种重要的生命活动基本现象，是机体内细胞数量维持动态平衡的基本方式之一。细胞凋亡在胚胎发育，细胞增殖，细胞清除衰老及病变的清除，肿瘤发生发展、自身免疫性疾病等多方面发挥重要作用。整个细胞凋亡过程是一个受到多种功能不同的基因共同调控的过程，根据凋亡过程中细胞形态，参与基因等的变化可以将细胞凋亡分为以下几个主要过程:细胞间接触凋亡信号，凋亡调控蛋白之间相互作用，蛋白水解酶的激活，激酶酶促活化级联反应，最终导致细胞凋亡。
　　细胞内凋亡过程的启动有多种信息系统参与，其中最主要的通路是以下两条:第一条是以细胞凋亡相关的膜受体通路为主要特征，第二条是一种生物化学途径，包括细胞色素C的释放及Caspases的激活。目前的研究结果表明，在哺乳动物有大概几十种基因直接参与了细胞凋亡的整个过程，间接参与的基因达到几百种。在参与凋亡过程的基因中，最主要的有三类基因:(1)Bcl-2家族基因，该家族既含有抑制凋亡的基因，同时也包含了多种促进凋亡的基因。这两类功能截然相反的基因在机体多种正常细胞和肿瘤细胞中均有表达。蛋白亚细胞定位的结果显示，Bcl-2家族蛋白在细胞内主要分布在线粒体膜、内质网膜和核膜等处;(2)fas基因属于肿瘤坏死因子受体基因家族成员，其配体FasL则属于肿瘤坏死因子基因家族成员。细胞在受到外源刺激情况下，Fas能够与其配体FasL结合，激活下游信号通路，从而导致细胞凋亡;(3)另一种重要的凋亡相关基因是p53基因，该基因编码的P53蛋白是一种促凋亡蛋白，同时P53也是一种DNA结合蛋白。该蛋白具有很强的转录激活活性，能够介导多种基因的转录表达。P53在不同的细胞中诱导凋亡的机制可以不同，经过多条信号通路的激活后最终可能都是通过对细胞内细胞色素C释放和Caspases的激活来完成细胞凋亡过程。
　　本文采用串联亲和纯化技术筛选与促细胞凋亡蛋白Bad(Bcl-xl/Bcl-2 associateddeath promoter)相互作用的细胞内蛋白。通过RT-PCR方法从HeLa细胞中获得bad全长基因，在蛋白编码序列氨基端融合FLAG及HA双标签，构建pcDNA3.0-Flag-HA-bad真核表达载体。进一步使用TAP串联亲和纯化方法以FLAG-HA-Bad作为诱饵筛选与其特异性结合的蛋白质并进行质谱鉴定。在筛选得到的多种蛋白中，我们从中选取了Gelsolin蛋白。进一步将gelsolin基因进行克隆，并采用免疫共沉淀方法确认了Bad蛋白与Gelsolin蛋白相互作用的存在。本研究成功建立了串联亲和纯化技术平台，分离出可与Bad相互作用的蛋白质。后续将进一步研究这两种蛋白相互作用对细胞凋亡的影响，以及进一步研究对肿瘤细胞的生长是否存在一定的抑制作用，有助于今后对癌症药物靶点寻找和分析药物治疗的抗肿瘤效果。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 细胞凋亡及特征

1．2 细胞凋亡(apoptosis)的生理意义

1．3 Bcl-2家族

1．4 Bad

1．5 Bad与Bcl-2家族

1．6 Gelsolin

1．7 串联亲和纯化

第2章 FLAG-HA-Bad双标签真核表达载体的构建

2．1 实验材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要试剂配制

2．1．3 主要实验仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 Trizol提取细胞RNA

2．2．3 RNA反转录cDNA

2．2．4 PCR扩增目的基因及基因克隆

2．2．5 PCR阳性克隆鉴定

2．2．6 质粒小量提取

2．2．7 去内毒素质粒大量提取

2．3 实验结果

2．3．1 融合质粒的构建与鉴定

2．4 实验讨论

第3章 Bad相互作用蛋白质筛选的串联亲和纯化及质谱分析

3．1 实验材料

3．1．1 主要试剂

3．1．2 主要试剂配制

3．1．3 主要实验仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 质粒转染细胞

3．2．2 Western blotting检测蛋白表达

3．2．3 TAP亲和纯化

3．2．4 质谱检测和分析

3．3 实验结果

3．3．1 瞬时转染

3．3．2 TAP亲和纯化及蛋白复合体的分离纯化与鉴定

3．3．3 质谱分析

3．4 实验讨论

第4章 免疫共沉淀(Co-IP)验证蛋白相互作用

4．1 实验材料

4．1．1 主要试剂和抗体

4．1．2 主要试剂配制

4．1．3 主要实验仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 免疫共沉淀(Co-IP)验证蛋白相互作用

4．3 实验结果

4．3．1 免疫共沉淀验证Bad与Gelsolin相互作用

4．4 实验讨论

第5章 讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介