人SmD1抗原的酵母真核表达及其初步应用

摘要

通过PCR扩增SmD1基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SmD1.用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清用十二烷基硫酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫酶斑点法(immunodot)鉴定.结果显示PCR产物约为360 bp,符合预期,pPIC9k-Sm D1重组阳性克隆双酶切鉴定正确,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致.表达产物Sm D1的分子量约16kD,高拷贝毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的.immunodot证实表达产物具有天然Sm D1分子的免疫原性.阴性对照菌未见目的表达条带.Immunodot的敏感性为96%,特异性为100%,与免疫印迹法(immunoblot,IBT)的符合率为98%.Sm D1在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达,为下一步研究打下了基础.