铁调节蛋白1真核表达质粒的构建及功能初步研究

摘要

目的:构建人来源铁调节蛋白1(IRP1)真核表达质粒,检测该质粒在人肝癌细胞(HepG2)中的表达及其对转铁蛋白受体1(TfR1)和二价金属转运体1(DMT1)表达的影响.方法:从HepG2细胞中提取总RNA,通过逆转录聚合酶链反应获得IRP1的cDNA.根据不同的酶切位点分别构建IRP1 4个分段目的基因,依次连接4段基因并将其构建入真核表达载体pcDNA3.1(+),测序验证碱基序列.用FuGENEHD将质粒pcDNA3.1 (+)-IRP1瞬时转染至HepG2.以QRT-PCR方法检测转染pcDNA 3.1(+)-IRP1质粒,观察对IRP1以及其调控基因TfR1和DMT1表达的影响.结果:扩增出IRP1全长cDNA,构建真核表达质粒,4个质粒经相应酶双酶切后,分子量分别为1261bp、502bp、600bp、310bp.经检测质粒转染至HepG2细胞后,IRP1表达显著高于转染空载质粒细胞.结果显示与对照组相比,转染真核pcDNA3.1(+)-IRP1质粒后IRP1表达显著上调约50倍,TfR1表达增加约3倍,DMT1表达增加约1.5倍,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论:成功构建人IRP1基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-IRP1,并证明其能在HepG2细胞内高表达,从而影响IRP1调控基因的表达.