质粒构建

摘要： 本文构建了pcDNA3.1(+)-TFEB-HA重组质粒,并转染了HeLa细胞进行表达。经Western Blot检测,转染pcDNA3.1(+)-TFEB-HA重组质粒的HeLa细胞成功表达了TFEB蛋白,为研究TFEB对细胞生长的影响提供了有利工具。

摘要： 目的:为后续进一步研究H1N1病毒DNA疫苗对小鼠免疫系统的影响提供技术支撑。方法:应用PCR方法体外扩增血凝素(HA)基因全序列,并利用pcDNA3.1(+)载体构建甲型流感病毒(H1N1)血凝素(HA)的真核表达质粒(pcDNA3.1(+)-HA),经双酶切鉴定后,转染293T细胞,通过RT-PCR和Western blot方法观察该重组质粒在293T细胞中的表达情况。结果表明,pcDNA3.1(+)-HA重组质粒构建成功;与空白及阴性对照相比,转染293T细胞48 h后的HA mRNA水平显著上升(2.4×10^(3),P<0.0001),并能在293T细胞中成功表达,为深入研究H1N1病毒DNA疫苗对小鼠免疫系统的影响奠定了基础。

摘要： 目的 构建敲减死亡相关蛋白激酶1(shDAPK1)基因的慢病毒质粒及稳转神经母细胞瘤细胞系(SH-SY5Y),并检测SH-SY5Y细胞中DAPK1敲减后对细胞凋亡的影响。方法 设计并合成特异性敲减DAPK1基因的上下游引物,将引物退火后与双酶切PLKO.1载体经T4连接酶连接、转化、提取质粒并进行DNA测序,获得重组正确的慢病毒干扰质粒pLKO.1-shDAPK1。将该重组的质粒与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞,72 h后收集慢病毒上清液,感染SH-SY5Y细胞,利用嘌呤霉素进行阳性筛选,得到稳定敲减DAPK1的SH-SY5Y细胞系。利用Western blot检测SH-SY5Y稳转细胞系中DAPK1蛋白以及用1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)处理后的Bax、Bcl-2及Caspase-3的蛋白表达水平,并应用流式细胞术检测SH-SY5Y细胞的凋亡情况。结果 重组pLKO.1-shDAPK1质粒的测序比对结果正确,嘌呤霉素筛选后获得shDAPK1稳转SH-SY5Y细胞系(shDAPK1-SY5Y),该稳转细胞系中DAPK1蛋白表达水平与对照组相比显著下降,此外还上调了Bcl-2蛋白的表达,下调Bax、Caspase-3蛋白的表达且流式检测结果显示该细胞系凋亡发生率明显下降。结论 成功构建了慢病毒敲减质粒pLKO.1-shDAPK1,并建立了DAPK1低表达的SH-SY5Y稳定感染细胞系,明显抑制了细胞凋亡。

摘要： 本实验成功构建了真核表达质粒pVAX1-IL-2,并对质粒进行PCR,双酶切及测序鉴定,RT-PCR成功验证了目的基因在MDBK细胞中能够转录,同时ELISA验证目的基因在MDBK细胞中能表达。研究结果为pVAX1-IL-2作为核酸疫苗的细胞因子佐剂的应用研究提供生物材料。

摘要： 目的利用巴斯德毕赤酵母获得具有可溶性、免疫原性的重组PD-L1蛋白。方法根据巴斯德毕赤酵母表达系统的密码子使用偏好,优化人PD-L1基因序列,将优化后的序列构建至质粒pPIC9K,合成重组质粒pPIC9K-PDL1。使用SacⅠ-HF将pPIC9K-PDL1线性化,然后通过电击法将pPIC9K-PDL1上的PD-L1基因序列整合至巴斯德毕赤酵母基因组中,依次使用MD平板(无组氨酸)和遗传霉素G418从电击处理过的菌液中筛选重组巴斯德毕赤酵母菌株,然后使用PCR和测序对筛选到的菌株进行鉴定。利用甲醇体积分数为0.005的BMMY培养基诱导重组巴斯德毕赤酵母菌株表达,使用免疫印迹法检测菌株培养基上清液中的表达产物。结果筛选得到了稳定表达PD-L1蛋白的重组巴斯德毕赤酵母菌株,表达的PD-L1相对分子质量约为44700,可以与抗PD-L1抗体特异性结合。结论成功构建了稳定表达PD-L1蛋白的重组巴斯德毕赤酵母菌株,菌株表达的PD-L1蛋白可用于开发血清PD-L1检测试剂盒。

摘要： 目的 构建表达携带切除修复交叉互补基因1(ERCC1)siRNA的人端粒酶反转录酶启动子(hTERT)及缺氧诱导因子(HIF)的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒(RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1,以下简称双调控腺病毒),作用于卵巢癌细胞后研究其抑瘤作用及相关分子机制,为卵巢癌的基因治疗奠定基础.方法 2018年1—12月,以人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)调控腺病毒Ela基因,缺氧调控元件序列(HRE)调控E1b基因,重组hTERT/HIF双调控双功效的肿瘤特异性溶瘤腺病毒载体;于E1区插入ERCC1基因序列设计特异基因构建双调控腺病毒.将构建好的病毒增加荧光载体,荧光显微镜下观察SKOV3人卵巢癌细胞中病毒转染情况.以噻唑蓝(MTT)实验检测不同组别癌细胞增殖活性,流式细胞术检测不同组别癌细胞凋亡情况.蛋白质印迹法检测SKOV3细胞中ERCC1蛋白、JAK/STAT、PI3K/Akt通路蛋白表达情况.结果 成功构建了双调控腺病毒,病毒能够在卵巢癌中高效转染并快速增殖,屏蔽ERCC1耐药基因,并具明显的抑瘤作用.MTT结果显示,24 h后双调控腺病毒对SKOV3细胞株具有明显增殖抑制,随着病毒数目增加抑制率逐渐上升,感染强度(MOI)=30时,卵巢癌SKOV3细胞增殖率下降到50％以下,且AD-ERCC1-siRNA组与AD-NC-siRNA组肿瘤抑制差异无统计学意义(P>0.05),AD-ERCC1-siRNA联合顺铂(74.19±3.04)％抑瘤作用较AD-NC-siRNA+DDP组(56.85±2.51)％更强.流式细胞术结果显示:AD-ERCC1-siRNA组细胞凋亡率(5.5±0.75)％较对照组(0.5±0.24)％明显升高.我们对病毒作用后的SKOV3细胞运用WB方法进行检测,结果显示作用后的细胞ERCC1蛋白表达(0.567±0.016)较对照组(1.612±0.072)下降(P0.05).结果提示,当病毒接触卵巢癌细胞24 h后发挥出对卵巢癌细胞较明显的抑瘤作用,且AD-ERCC1-siRNA组与AD-NC-siRNA组无明显差异,在感染强度(MOI)=30时,卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制率下降到50％以下.结论 双调控腺病毒成功构建且具备高转染效率,该病毒对卵巢癌SKOV3细胞株有明显生长抑制及促凋亡作用,可能与JAK/STAT通路激活有关,而且该病毒能增强顺铂的用药效果,其机制可能与该病毒成功屏蔽ER-CC1耐药基因有关.

摘要： 本研究旨在利用内蒙古绒山羊Wnt10b基因构建干扰质粒并转染耳皮肤细胞检测基因表达.以1岁龄内蒙古绒山羊为研究对象,扩增Wnt10b基因CDS序列,连接到pSGU6载体,构成pSGU6-Wnt10b重组质粒,并使用感受态细胞大量扩增提取,所得质粒转染至生长状态良好的内蒙古绒山羊耳皮肤细胞中,提取RNA利用Real Time PCR技术检测细胞中Wnt10b基因表达情况.结果显示:pSGU6-Wnt10b干扰载体经测序鉴定证明构建成功,转染至耳皮肤细胞24 h后出现绿色荧光,并在48 h后荧光强度最高,转染效率达到最大,实验组中Wnt10b mRNA表达量显著低于对照组.

摘要： 轮状病毒是威胁大熊猫健康的主要病原微生物之一.为了对大熊猫轮状病毒进行快速、方便且准确地检测,研发适合于基层饲养单位和保护区的检测方法是非常有必要的.本研究通过合成大熊猫轮状病毒Vp7基因序列,构建了 PUC-VP7的重组质粒,并将其作为阳性对照对大熊猫轮状病毒样本进行PCR检测和分析.结果表明,在进行PCR扩增分析时,该质粒和病毒cDNA二者均在340 bp处出现了特异性条带.此外,对收集到的45份大熊猫粪便样本进行轮状病毒抗原检测时,其中2份样品在340 bp处出现条带,该基因片段与大熊猫轮状病毒CH-1株的相似性为99.89％.本研究构建的PUC-VP7质粒不但可以作为大熊猫轮状病毒PCR检测中的阳性质控品,而且还能有效地促进该PCR病毒检测技术在基层饲养单位和保护区的推广和应用.

摘要： 旨在深入研究非经典细胞焦亡的激活机制,本研究在体外构建非经典细胞焦亡模型,利用PCR方法扩增人源目的 基因Caspase-4、hGSDMD-FL和hGSDMD-p 30,使用无缝克隆的方法连接到相应的载体中,构建重组真核表达质粒pCMV MY&Caspase4、p3XFLAG-hGSDMD-FL和pcDNA3.1 hGSDMD-p30 MYC,利用VigoFect试剂转染到HEK293T细胞后,采用Western blot方法验证各蛋白的表达情况;通过质粒共转染的方法构建非经典的细胞焦亡模型,分别检测细胞上清中LDH的释放、GSDMD有无被切割为有活性的N端p30片段和荧光观察PI染色情况来确定非经典细胞焦亡模型是否构建成功.结果 显示:pCMV-MYC-Caspase-4、p3XFLAG-hGSDMD-FL重组质粒均成功构建,各蛋白于HEK293T细胞内均成功表达,质粒共转染后LDH分泌显著升高,Caspase-4将GSDMD全长片段切割为有活性N端GSDMDp30片段,荧光显微镜观察到明显的PI染色,表明非经典细胞焦亡模型体外构建成功.非经典细胞焦亡模型在体外的成功构建,为进一步研究其激活机制奠定了基础.

摘要： 目的 构建PMLA216T-RARα过表达质粒,并研究雄黄对其蛋白产物的影响及机制.方法 通过资料库及文献获得PML、RARα的mRNA序列,以及PML-RARα[的融合位点.设计引物后,通过聚合酶链反应获得目的 片段,通过无缝克隆技术连接两个片段,插入突变,并与载体质粒相连接,测序验证.转染质粒至HL-60细胞,血清饥饿法处理24 h后用Western blot观察PML-RARα、p-mTOR、p62、LC3B水平变化;不同浓度的雄黄处理24 h后,用Western blot观察PML-RARα、p-mTOR、p62、LC3B水平变化.结果 测序结果显示质粒构建成功,序列符合预期设计.1、2、4、8μmol/L雄黄处理后PMLWT-RARα和PMLA216T-RARα水平低于未经雄黄处理(0μmol/L)的PMLWT-RARα和PMLA216T-RARα水平,差异有统计学意义(P＜0.05);0.5 μmol/L雄黄处理后PMLWT-RARα水平低于未经雄黄处理的PMLWT-RARα水平,差异有统计学意义(P＜0.05).相同浓度雄黄处理后PMLA216T-RARα水平高于PMLWT-RARα水平,差异有统计学意义(P＜0.05).5％ FBS和未经FBS处理的PMLA216T-RARα、p-mTOR水平低于10％ FBS处理的PMLA216T-RARα、p-mTOR水平,p62、LC3B水平高于10％ FBS处理的PMLA216T-RARα水平,差异有统计学意义(P＜0.05).4、8、16、32、64 μmol/L雄黄处理后PMLA216T-RARα水平低于未经雄黄处理的PMLA216T-RARα水平,差异有统计学意义(P＜ 0.05);8、16、32、64μmol/L雄黄处理后p-mTOR、p62水平低于未经雄黄处理的p-mTOR、p62水平,LC3B水平高于未经雄黄处理的LC3B水平,差异有统计学意义(P＜0.05);16 μmol/L雄黄处理后p-mTOR、p62水平低于8μmol/L雄黄处理后的p-mTOR、p62水平,LC3B水平高于8 μmol/L雄黄处理后的LC3B水平,差异有统计学意义(p＜0.05).结论 错义突变型PMLA216T-RARα过表达质粒构建成功,高浓度雄黄可能通过选择性自噬下调PMLA216T-RARα.

摘要： 人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的催化亚基,hTERT的激活和表达程度与肿瘤的发生、发展和恶性程度密切相关,阻碍hTERT对端粒的延伸作用,可导致肿瘤细胞衰老和死亡.采用脂质体转染法将真核重组质粒转染入了宫癌Hela细胞和永生化的293T细胞中，通过免疫印迹法检测目的蛋白在细胞中的表达情况。结果表明hTERTC端第936-1132氨基序列所编码的蛋自对子宫癌Hela细胞和永生化293T细胞的增殖能力和细胞活性具有抑制作用，其抑制作用机制可能与阻断端粒酶和端粒的结合，导致端粒不能延伸有关。

摘要： 本研究应用真核表达载体pcDNA3.1(+)和猪白细胞介素2(IL-2)基因成功构建了IL-2的真核表达质粒(pcDNA-IL-2),探讨pcDNA-IL-2作为分子免疫佐剂对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)ORF5基因疫苗(pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5)免疫猪的增强作用.经间接ELISA法、MTT比色法及流式细胞仪分别对pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫猪、pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5单独免疫猪、pcDNA3.1(+)空载体和灭菌水免疫对照猪的血清抗PRRSV抗体IgG、外周血T淋巴细胞的增殖活性、CD4+和CD8+百分含量进行检测,结果表明pcDNA-IL-2与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5共同免疫猪的IgG含量、外周血T淋巴细胞的增殖活性、CD4+和CD8+百分含量与pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5单独免疫猪相比有显著差异(p＜0.05).说明pcDNA-IL-2能显著增强pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5基因疫苗免疫猪的体液和细胞免疫应答,可作为PRRSV基因疫苗的良好佐剂.

摘要： 目的:检测斑马鱼不同组织、不同时相胚胎的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)酶活性.构建g6pdpCS2+、mutant g6pd-pCS2+、g6pd-EGFP-pCS2+、mutant g6pd-EGFP-pCS2+重组质粒.观察斑马鱼中g6pd的表达情况,为构建G6PD缺乏症的斑马鱼疾病模型奠定基础.方法:1.运用改良的G6PD定量比值法检测成年斑马鱼各组织以及不同时相的胚胎中G6PD酶活性;2.重组质粒的构建:(1)提取野生型斑马鱼Total RNA,将RNA逆转录为斑马鱼cDNA,通过RT-PCR法克隆得到斑马鱼g6pd基因全长,将g6pd基因与pCS2+空载体连接获得g6pd-pCS2+重组质粒;(2)利用g6pd-pCS2+重组质粒制备地高辛标记的反义mRNA探针,在野生型斑马鱼Tuebingen进行原位杂交,观察g6pd基因的表达情况.结果:1.用改良的G6PD定量比值法检测野生型成年斑马鱼脑、眼睛、鱼鳃、肠、肌肉、皮肤以及血等各组织G6PD酶活性，结果:脑1.7307±0.1673、眼睛1.7085±0.2230、鱼鳃1.7347±0.1901、肠1.7501±0.2241、肌肉1.7201±0.1573、皮肤1.7460±0.1756、血1.7012±0.1902，斑马鱼体积较小，血量较少，但本研究发现在斑马鱼的各个组织当中同样能够检测斑马鱼的酶活性。同时利用相同的方法检测斑马鱼胚胎各时相的酶活性，包括24小时、48小时、5天、15天，检测结果如下:24小时1.7429±0.1701,48小时1.7495±0.1296,5天1.7118±0.2236,15天1.7621±0.169002.成功设计突变体mutant g6pd基因。结论:1.本研究采用改良的G6PD定量比值法在野生型斑马鱼中检测各个组织及各个时相胚胎的G6PD酶活性，首次建立了检测斑马鱼G6PD酶活性的技术。2.本研究所得的结果提示斑马鱼中不同组织以及不同的胚胎酶活性检测结果无显著差异，通过在斑马鱼中检测不同组织及不同时相胚胎的G6PD酶活性，在斑马鱼中建立了G6PD酶活性的标准值。

摘要： 目的:检测斑马鱼不同组织、不同时相胚胎的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)酶活性.构建g6pdpCS2+、mutant g6pd-pCS2+、g6pd-EGFP-pCS2+、mutant g6pd-EGFP-pCS2+重组质粒.观察斑马鱼中g6pd的表达情况,为构建G6PD缺乏症的斑马鱼疾病模型奠定基础.方法:1.运用改良的G6PD定量比值法检测成年斑马鱼各组织以及不同时相的胚胎中G6PD酶活性;2.重组质粒的构建:(1)提取野生型斑马鱼Total RNA,将RNA逆转录为斑马鱼cDNA,通过RT-PCR法克隆得到斑马鱼g6pd基因全长,将g6pd基因与pCS2+空载体连接获得g6pd-pCS2+重组质粒;(2)利用g6pd-pCS2+重组质粒制备地高辛标记的反义mRNA探针,在野生型斑马鱼Tuebingen进行原位杂交,观察g6pd基因的表达情况.结果:1.用改良的G6PD定量比值法检测野生型成年斑马鱼脑、眼睛、鱼鳃、肠、肌肉、皮肤以及血等各组织G6PD酶活性，结果:脑1.7307±0.1673、眼睛1.7085±0.2230、鱼鳃1.7347±0.1901、肠1.7501±0.2241、肌肉1.7201±0.1573、皮肤1.7460±0.1756、血1.7012±0.1902，斑马鱼体积较小，血量较少，但本研究发现在斑马鱼的各个组织当中同样能够检测斑马鱼的酶活性。同时利用相同的方法检测斑马鱼胚胎各时相的酶活性，包括24小时、48小时、5天、15天，检测结果如下:24小时1.7429±0.1701,48小时1.7495±0.1296,5天1.7118±0.2236,15天1.7621±0.169002.成功设计突变体mutant g6pd基因。结论:1.本研究采用改良的G6PD定量比值法在野生型斑马鱼中检测各个组织及各个时相胚胎的G6PD酶活性，首次建立了检测斑马鱼G6PD酶活性的技术。2.本研究所得的结果提示斑马鱼中不同组织以及不同的胚胎酶活性检测结果无显著差异，通过在斑马鱼中检测不同组织及不同时相胚胎的G6PD酶活性，在斑马鱼中建立了G6PD酶活性的标准值。

摘要： 目的:检测斑马鱼不同组织、不同时相胚胎的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)酶活性.构建g6pdpCS2+、mutant g6pd-pCS2+、g6pd-EGFP-pCS2+、mutant g6pd-EGFP-pCS2+重组质粒.观察斑马鱼中g6pd的表达情况,为构建G6PD缺乏症的斑马鱼疾病模型奠定基础.方法:1.运用改良的G6PD定量比值法检测成年斑马鱼各组织以及不同时相的胚胎中G6PD酶活性;2.重组质粒的构建:(1)提取野生型斑马鱼Total RNA,将RNA逆转录为斑马鱼cDNA,通过RT-PCR法克隆得到斑马鱼g6pd基因全长,将g6pd基因与pCS2+空载体连接获得g6pd-pCS2+重组质粒;(2)利用g6pd-pCS2+重组质粒制备地高辛标记的反义mRNA探针,在野生型斑马鱼Tuebingen进行原位杂交,观察g6pd基因的表达情况.结果:1.用改良的G6PD定量比值法检测野生型成年斑马鱼脑、眼睛、鱼鳃、肠、肌肉、皮肤以及血等各组织G6PD酶活性，结果:脑1.7307±0.1673、眼睛1.7085±0.2230、鱼鳃1.7347±0.1901、肠1.7501±0.2241、肌肉1.7201±0.1573、皮肤1.7460±0.1756、血1.7012±0.1902，斑马鱼体积较小，血量较少，但本研究发现在斑马鱼的各个组织当中同样能够检测斑马鱼的酶活性。同时利用相同的方法检测斑马鱼胚胎各时相的酶活性，包括24小时、48小时、5天、15天，检测结果如下:24小时1.7429±0.1701,48小时1.7495±0.1296,5天1.7118±0.2236,15天1.7621±0.169002.成功设计突变体mutant g6pd基因。结论:1.本研究采用改良的G6PD定量比值法在野生型斑马鱼中检测各个组织及各个时相胚胎的G6PD酶活性，首次建立了检测斑马鱼G6PD酶活性的技术。2.本研究所得的结果提示斑马鱼中不同组织以及不同的胚胎酶活性检测结果无显著差异，通过在斑马鱼中检测不同组织及不同时相胚胎的G6PD酶活性，在斑马鱼中建立了G6PD酶活性的标准值。

摘要： 目的:检测斑马鱼不同组织、不同时相胚胎的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)酶活性.构建g6pdpCS2+、mutant g6pd-pCS2+、g6pd-EGFP-pCS2+、mutant g6pd-EGFP-pCS2+重组质粒.观察斑马鱼中g6pd的表达情况,为构建G6PD缺乏症的斑马鱼疾病模型奠定基础.方法:1.运用改良的G6PD定量比值法检测成年斑马鱼各组织以及不同时相的胚胎中G6PD酶活性;2.重组质粒的构建:(1)提取野生型斑马鱼Total RNA,将RNA逆转录为斑马鱼cDNA,通过RT-PCR法克隆得到斑马鱼g6pd基因全长,将g6pd基因与pCS2+空载体连接获得g6pd-pCS2+重组质粒;(2)利用g6pd-pCS2+重组质粒制备地高辛标记的反义mRNA探针,在野生型斑马鱼Tuebingen进行原位杂交,观察g6pd基因的表达情况.结果:1.用改良的G6PD定量比值法检测野生型成年斑马鱼脑、眼睛、鱼鳃、肠、肌肉、皮肤以及血等各组织G6PD酶活性，结果:脑1.7307±0.1673、眼睛1.7085±0.2230、鱼鳃1.7347±0.1901、肠1.7501±0.2241、肌肉1.7201±0.1573、皮肤1.7460±0.1756、血1.7012±0.1902，斑马鱼体积较小，血量较少，但本研究发现在斑马鱼的各个组织当中同样能够检测斑马鱼的酶活性。同时利用相同的方法检测斑马鱼胚胎各时相的酶活性，包括24小时、48小时、5天、15天，检测结果如下:24小时1.7429±0.1701,48小时1.7495±0.1296,5天1.7118±0.2236,15天1.7621±0.169002.成功设计突变体mutant g6pd基因。结论:1.本研究采用改良的G6PD定量比值法在野生型斑马鱼中检测各个组织及各个时相胚胎的G6PD酶活性，首次建立了检测斑马鱼G6PD酶活性的技术。2.本研究所得的结果提示斑马鱼中不同组织以及不同的胚胎酶活性检测结果无显著差异，通过在斑马鱼中检测不同组织及不同时相胚胎的G6PD酶活性，在斑马鱼中建立了G6PD酶活性的标准值。

摘要： 本试验将靶向猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能.用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况.结果表明本试验所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制.

摘要： 本试验将靶向猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能.用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况.结果表明本试验所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制.

摘要： 本试验将靶向猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能.用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况.结果表明本试验所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制.

摘要： 本试验将靶向猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能.用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况.结果表明本试验所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制.

摘要： 本发明涉及一种植物及部分真菌T?DNA转化和T?DNA插入突变体库构建所使用的双元Ti质粒载体及其构建方法。首先，在质粒T?DNA区的两端都整合了绿色荧光蛋白报告基因sGFP的启动子捕获模块，并对两端sGFP开放阅读框之前的核酸序列进行了优化调整；其次，质粒拯救的功能模块也通过酶切位点整合到目标质粒中；最后，质粒整合了用于筛选转化子的潮霉素抗性基因，并且该基因及其启动子可以通过Sac I酶切位点进行自由替换，以适应不同的筛选目的和物种。双元Ti质粒载体的选择及其各模块的配置和优化会对转基因的效率、基因克隆及相关基因功能验证的便利性产生很大的影响。通过将多种质粒功能模块有机的整合到一个质粒上，既扩大了质粒的适用范围，又提高了筛选及克隆目标功能基因的效率，为找寻有益基因及其功能验证提供了一个很好的分子工具。

摘要： 本发明涉及用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒，该质粒由PGEM-T easy载体和串联在一起的PA基因、capA基因、rpoB基因组成，记为PGEM-T-easy-RCP；还涉及包括上述重组标准质粒的试剂盒；还涉及上述重组标准质粒的构建方法，包括以下步骤：设计引物对、扩增序列、构建第一中间质粒、构建第二中间质粒、构建重组标准质粒。本发明的重组标准质粒PGEM-T-easy-RCP可作为炭疽杆菌阳性标准品(即炭疽杆菌强毒株核酸)的替代品。

摘要： 本发明提供一组用于活体荧光标记类鼻疽伯克霍尔德菌的表达质粒，同时还进一步提供了包含红、绿或蓝荧光蛋白的表达质粒。本发明还公开了荧光表达质粒的组成元件、酶切位点和基因序列，以及其在类鼻疽菌中活体荧光标记的方法，并进一步公开了红色荧光标记类鼻疽菌在其感染致病研究中的应用。本发明提供了一组活体荧光标记类鼻疽菌的质粒，有助于对类鼻疽菌感染致病过程的动态研究。

摘要： 本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种构建FSCN1基因稳定敲除细胞系方法及质粒或质粒组合和应用。本发明的目的是针对siRNA转染瞬时敲降FSCN1方法的不稳定性和不彻底性，提供一种从基因组中稳定敲除FSCN1基因的方法，该方法除了用于研究FSCN1功能外，还可以用于构建FSCN1基因敲除细胞系。本发明所提供的基于CRISPR‑Cas9系统构建FSCN1基因敲除细胞系的方法，所述方法以人FSCN1基因第一外显子中的蛋白编码序列和第五外显子中的蛋白编码序列中符合5‘‑G‑N18‑NGG‑3或5‘‑G‑N20‑NGG‑3’或5’‑CCN‑N18‑C‑3’或5’‑CCN‑N20‑C‑3’序列规则排列的片段的“N18或N20”为靶序列；N表示A、T、C、G中的任一种，其中“N18”和“N20”分别为18和20个脱氧核苷酸。

摘要： 本发明涉及一种植物及部分真菌T-DNA转化和T-DNA插入突变体库构建所使用的双元Ti质粒载体及其构建方法。首先，在质粒T-DNA区的两端都整合了绿色荧光蛋白报告基因sGFP的启动子捕获模块，并对两端sGFP开放阅读框之前的核酸序列进行了优化调整；其次，质粒拯救的功能模块也通过酶切位点整合到目标质粒中；最后，质粒整合了用于筛选转化子的潮霉素抗性基因，并且该基因及其启动子可以通过Sac I酶切位点进行自由替换，以适应不同的筛选目的和物种。双元Ti质粒载体的选择及其各模块的配置和优化会对转基因的效率、基因克隆及相关基因功能验证的便利性产生很大的影响。通过将多种质粒功能模块有机的整合到一个质粒上，既扩大了质粒的适用范围，又提高了筛选及克隆目标功能基因的效率，为找寻有益基因及其功能验证提供了一个很好的分子工具。

摘要： 本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种真核表达重组质粒及其构建方法与稳定表达该质粒的Vero细胞系。该真核表达重组质粒具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。应用稳定表达该质粒的Vero细胞系，可以对犬瘟热病毒强毒株进行高效分离及用于犬瘟热病毒致病机制的研究。

摘要： 本发明涉及用于检测炭疽杆菌的重组标准质粒，该质粒由PGEM-T easy载体和串联在一起的PA基因、capA基因、rpoB基因组成，记为PGEM-T-easy-RCP；还涉及包括上述重组标准质粒的试剂盒；还涉及上述重组标准质粒的构建方法，包括以下步骤：设计引物对、扩增序列、构建第一中间质粒、构建第二中间质粒、构建重组标准质粒。本发明的重组标准质粒PGEM-T-easy-RCP可作为炭疽杆菌阳性标准品(即炭疽杆菌强毒株核酸)的替代品。

摘要： 本发明涉及一种重组DNA质粒，包括肝癌相关多肽抗原决定簇和白细胞介素，本发明也涉及该质粒的构建方法。本发明进一步涉及含有所述质粒的多价疫苗，及所述的质粒和疫苗在制备抗肝癌药物中的应用。

摘要： 本发明提供了一种质粒构建试剂盒、质粒构建方法及其应用，所述试剂盒包括待组装的DNA片段F

摘要： 本发明提供了一种超大质粒构建试剂盒、超大质粒构建方法及其应用，所述试剂盒包括待组装的DNA片段F