含人CCR5Delta32基因重组慢病毒的包装及滴度测定

摘要

目的:包装含人CCR5Delta32基因的重组慢病毒并测定其滴度,用于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗研究.方法:从CCR5Delta32突变个体外周血单个核细胞(PBMC)中提取人基因组DNA,利用PCR技术扩增CCR5Delta32全长基因,经EcoRⅠ单酶切后与pUCm-T载体连接,随后转化E.coli DH5α,提取质粒进行酶切鉴定及DNA测序;将鉴定正确的CCR5Delta32基因亚克隆至慢病毒载体pknti6/V5-D-TOPO并进行酶切鉴定及DNA序列分析;用pLP1、pLP2、pLP/VSVG及pknti-CCR5Delta32等4种质粒共转染293T细胞,产生重组慢病毒并测定其滴度.结果:克隆出人CCR5Delta32基因,并构建了含该基因的重组慢病毒载体,经293T细胞包装后产生5×105 TU/mL的重组慢病毒.结论:高滴度含人CCR5Delta32基因重组慢病毒的包装,为进一步的AIDS基因治疗研究奠定了基础.