载体介导的小干扰RNA诱导p53基因的沉默

摘要

目的:筛选有效抑制p53基因表达的靶位点,以研究其在哺乳动物细胞中的功能.方法:用Ambion公司的RNA干扰(RNAi)设计软件设计了3段针对野生型p53基因的长度为19 nt的反向重复序列,在人工退火条件下形成双链,将其构建到pSilencer3.1-H1 neo载体上,与pcDNA3.1-HA-p53(野生型)载体共转染Cos7及293T细胞,用Western blot检测HA-p53蛋白质的表达;将pCMV-GFP-p53与p53-RNAi或空载体共转入Cos7细胞,于激光扫描共聚焦显微镜下比较GFP-p53的表达;将p53-RNAi和空载体分别转入BEL-7405-p53-RE-luc+细胞,在不同剂量化疗药物阿霉素的作用下,通过活体成像仪观察内源p53的表达;利用G418(neo)筛选获得稳定整合p53-RNAi的H460细胞(p53野生型)株,用流式细胞仪分析正常及p53基因沉默细胞的周期变化.结果:筛选到一个有效的p53基因沉默位点,并在H460细胞中得到p53基因沉默的稳定细胞株.结论:获得了有效的p53基因RNAi位点,为进一步研究p53基因在细胞中的功能提供了有力的工具.