重组小鼠血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和纯化

摘要

目的：建立毕赤酵母重组小鼠血管内皮生长因子(mVEGF)的制备方法,为研究 mVEGF 的生物活性、抗原性等提供基础.方法：通过全基因合成方法获得编码 mVEGF 的基因片段,将其克隆至表达载体 pPICZαA 上,电转化整合到毕赤酵母 GS115基因组中,用甲醇诱导表达目的蛋白,表达上清经硫酸铵沉淀、Sephadex G25柱脱盐、阳离子交换层析三步纯化获得目的蛋白；用还原型和非还原型 SDS-PAGE 检测目的蛋白的聚体状态,用 Western 印迹验证纯化蛋白；通过 PNGase F 酶切分析目的蛋白的 N-糖基化修饰；通过人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验检测目的蛋白的生物活性.结果：获得 mVEGF 的重组毕赤酵母表达菌株,SDS-PAGE 分析可见 GS115表达的重组 mVEGF 在还原状态下表观相对分子质量约为20×103,在非还原状态下约为40×103；经 Western 印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,能被兔抗 mVEGF 抗体特异性结合,PNGase F 酶切后相对分子质量降至18×103左右,证明目的蛋白发生了 N-糖基化修饰；细胞测活实验表明,mVEGF 具有刺激 HUVEC 增殖的生物活性.结论：利用毕赤酵母菌制备了具有生物活性的重组 mVEGF.%10.3969/j.issn.1009-0002.2012.06.005