人自噬相关蛋白ATG5的原核表达及纯化

摘要

目的:原核表达纯化带His标签的自噬相关蛋白ATG5.方法:利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人A TG5基因的编码序列,插入载体pET-28a(+)中得到重组质粒,经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Rossate进行小量诱导,挑选出可以诱导His-ATG5蛋白的菌液进行融合蛋白的纯化,通过Western印迹和SDS-PAGE检测融合蛋白的纯化效果.结果:用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约828 bp的目的片段,插入载体pET-28a(+)构建出His-ATG5重组质粒并经酶切及测序验证;转化大肠杆菌Rossate后进行小量诱导表达并纯化蛋白,SDS-PAGE检测显示获得相对分子质量约为38×103的融合蛋白.结论:原核表达并纯化获得His-ATG5融合蛋白,为后续研究ATG5在自噬中的作用机制奠定了实验基础.