肺表面活性物质相关蛋白C和A原核表达载体的构建、表达及纯化

摘要

研究背景
　　 肺表面活性物质(pulmonarysurfactant，PS)是由磷脂和蛋白质组成的一种具有高度表面活性的复合物，磷脂含量为85％-90％，蛋白质含量为8％-10％。存在于被覆肺泡表面的液体中，其结合的特异性蛋白为肺表面活性物质相关蛋白，共有4种，小分子疏水性肺表面活性蛋白B与C，分子量分别为6-8KD和3-5KD，大分子亲水性肺表面活性蛋白A与D，分子量分别为28-36KD及43KD。
　　 人类肺表面活性物质相关蛋白C（surfactantassociatedproteinC，SP-C）基因全长2.4kb，定位于第8号染色体短臂，5个内含子和6个外显子，仅表达于肺泡Ⅱ型上皮细胞。SP-C基因最初可编码产生含191～197个氨基酸、分子量为21KD的蛋白质初级产物SP-C蛋白前体。非成熟的SP-C蛋白前体需经过多步复杂的酶解过程才能分化为成熟并具有生理活性的小分子疏水性蛋白SP-C，具有促进磷脂在肺泡表面形成稳定的单分子层，从而降低肺泡表面张力、防止呼气末肺泡塌陷、增加肺顺应性、促进肺间质液体回流及参与肺器官局部防御体系等重要的生理功能。
　　 肺表面活性物质相关蛋白A（surfactantassociatedproteinA，SP-A）SP-A基因定位于10号染色体长臂q21～q24，核苷酸长度约为4.5Kb，包含两个功能基因SP-A1、SP-A2和一个假基因。SP-A由两种基因编码:SP-A1和SP-A2，94％的核苷酸序列和96％的氨基酸序列相同.SP-A基因最初可编码产生含248-263个氨基酸.SP-A单体是一种糖蛋白，相对分子量为26-38KD，由Ⅱ型肺泡上皮细胞和Clara细胞合成和分泌。天然的SP-A由6个SP-A组成并形成一个“花束状”结构。其作用包括以下几个方面①参与肺泡表面活性膜的形成和代谢，与小分子肺表面活性物质蛋白B协同，促进表面活性物质板层体转化为管髓体结构，继而参与小分子疏水性肺表面活性物质蛋白B与C扩展管髓体为磷脂单分子层的作用;②通过受体介导，增加肺泡Ⅱ型上皮细胞摄取脂质，抑制磷脂分泌，稳定细胞内外肺表面活性物质水平，保证肺泡肺表面活性物质含量适当;③肺表面活性蛋白A增加肺泡Ⅱ型上皮细胞抗氧化能力;④肺表面活性蛋白A与D参与细胞免疫，对免疫细胞（尤其是单核巨噬细胞、中性粒细胞）具有趋化和调理吞噬作用;⑤肺表面活性蛋白A与D调节炎性及过敏反应，抑制T细胞增生，减轻肺过敏性反应或其它毒性物质在肺部的变态反应。
　　 胎肺从24周开始有肺表面活性物质蛋白分泌，32-34周达到高峰，SP-A是最先被发现且在肺泡Ⅱ型上皮细胞中表达最强烈、信号最丰富的蛋白，约占SP总量的50％，与肺成熟度密切相关。SP-A与新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)、成人呼吸窘迫综合征、肺炎、哮喘、肺泡蛋白沉积症(PAP)、特发性肺间质纤维化(IPF)、结节病、肺腺癌、系统性硬化等的发病和转归密切相关。SFTPC基因表达异常可致SP-C蛋白含量、结构变化和功能丧失进而导致新生儿严重的肺间质性疾病、婴幼儿肺间质性疾病如类肉瘤病、弥漫性肺部疾病及部分成人家族性肺纤维化，最后导致呼吸衰竭，这些已经被实验和临床研究所证实。因此寻找一种简便、高效的方法检测SP的含量对于预测与之相关的疾病临床意义重大。
　　 目前许多评估肺成熟的方法大部分是以PS为分析对象的。大体可分为生物化学方法和生物物理学方法两类。生物化学方法是定量分析一种或几种表面活性物质成分的绝对量或相对量，包括卵磷脂/鞘磷脂(L/S)测定、磷脂酰甘油(PG)测定、饱和卵磷脂测定等;生物物理学方法是通过评价羊水或痰液中肺表面活性物质成分的肺表面活性或物理效应来判断肺成熟度，包括泡沫振荡实验、荧光偏振评价FLM、分光光度计、LB计数等;卵磷脂/鞘磷脂(L/S)测定、磷脂酰甘油(PG)测定生物化学方法操作复杂，需时长，容易受羊水血性污染的影响，使用受到一定的限制。生物物理学方法除泡沫振荡实验（主观性太强）外，其他均需要特定的仪器设备，且在羊水受到血液或阴道分泌物污染时，准确率差;由于以上方法的不同缺陷，故目前建立一种非常简便、准确，可被大家广泛接受并应用的肺成熟度检测方法，仍是探索的热点。
　　 SP-A含量的检测对于上述多种疾病的诊断和预后具有很大的价值。杜风兰等研究脐血SP-A水平与羊水SP-A水平的相关性，证明脐血可以代替羊水SP-A中水平作为胎肺成熟度的标志，利用westernblot方法，得到斑点杂交结果后用凝胶图象分析系统测定NC膜上各点的相对灰度值，根据标准蛋白相对灰度值曲线，求得待测标本SP-A的实际含量，尚无法达到精确测定的标准。YoshioKuroki等利用双抗体夹心ELISA检测样本中SP-A，检测范围10～1280ng。此后，以SP-A单克隆抗体为基础的双抗体夹心ELISA技术被广泛应用于SP-A的检测，在SP-A的研究中发挥了重要的作用。KojiKaneko等人通过检测24h内新生儿脐带血及外周血中SP-A含量预测新生儿呼吸窘迫综合症的发生，确定SP-A是预测胎儿肺成熟度的重要标志。对于肺表面活性物质蛋白SP-C来说，目前主要的检测方法为通过基因检测的方法了解其基因突变位点，从而确定诊断。多数SFTPC基因突变患者存在其SP-C蛋白表达量异常，由于基因诊断价格昂贵，而且耗时较长，可通过检测SP-C蛋白有无变化进行筛查，从而提高预测肺间质性疾病的效率。
　　 目前国内市场尚无自研的肺表面活性物质蛋白含量检测试剂盒，而进口试剂盒价格昂贵，不宜推广使用。故研制定量检测肺表面活性物质试剂盒意义重大。而提取SP-A、SP-C蛋白是研制检测试剂盒的关键一步，本实验室曾采用maltosyl-agarose柱层析法从人肺支气管肺泡灌洗液(BALF)中提取出高纯度、高活性、结构正常的SP-A，2个成人尸肺中提取的SP-A含量约40mg。但该方法步骤繁琐，产量少，更重要是尸体肺来源困难，用这种方法提取蛋白作为试剂盒的标准品来源不现实。SP-C分子量小，体内含量比SP-A更低，提取更困难。故利用基因工程方法合成目的蛋白后，将其作为抗原免疫动物，同时作为制备试剂盒的标准品是最佳的选择。
　　 本实验室用人尸肺提取的SP-A蛋白作为抗原，免疫BABL/c小鼠，提取脾细胞后与骨髓瘤细胞融合，经过筛选抗体后建立了SP-A单克隆细胞株，并能分泌高效价有活性的SP-A单克隆抗体，为研制SP-A检测试剂盒做好了准备（但试剂盒的标准品来源仍有困难）。故本课题拟用原核生物大肠杆菌表达SPA和SPC目的蛋白，具体研究内容包括以下几个步骤:RT-PCR获取目的基因、T-A克隆、PET-28a/SP-C及PET-28a/SP-A重组质粒的构建、SP-C、SP-A重组蛋白的原核表达及纯化、鉴定、目的蛋白的抗原性检测。
　　 第一步RT-PCR获取目的基因
　　 目的:通过逆转录-聚合酶链反应获取目的基因SFTPA，SFTPC。进行TA克隆，克隆PCR产物，提高PCR产物的连接、克隆效率。
　　 方法:提取肺组织总RNA后进行逆转录-聚合酶链反应，2％的琼脂糖凝胶电泳检测。利用PMD-18T载体反应试剂盒，连接纯化的目的DNA与PMD18T载体，并转入感受态细胞DH5α，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。
　　 结果:成功提取到肺组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测可见28s和18s两条条带亮度清晰，紫外分光光度计分析A260/A280为1.923，获得的目的基因2％琼脂糖凝胶电泳结果与其分子量相符;经Amp抗性和蓝白显色筛选，见培养板上长出蓝白斑比例约为16:1，总菌落数约32个。挑取白色单菌落接种扩增后提取质粒。经序列测定后，以BamHⅠ和HindⅢ双酶切，回收并纯化。
　　 结论:通过逆转录-聚合酶链反应成功获得SFTPA，SFTPC目的基因。通过TA克隆的方法，可以成功克隆PCR产物。
　　 第二步PET-28a/SP-A，PET-28a/SP-C原核表达载体的构建
　　 目的:构建PET-28a/SP-C，PET-28a/SP-A重组质粒。
　　 方法:将表达质粒PET-28a及目的基因SP-A、SP-C进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，过夜连接，连接后的重组质粒转化至大肠杆菌BL-21感受态菌中，加入800μL无抗生素的LB液体培养基中培养2h，取50μL涂板(含Kana)后，37℃过夜培养。用无菌牙签挑取单菌落于5mL含50μg/(1)Amp的LB液体培养基中培养6h，再行质粒提取与双酶切鉴定，鉴定为阳性重组质粒送基因公司测序。
　　 结果:将重组质粒送至基因公司测序，与genebank上公布的人肺表面活性物质相关蛋白基因序列一致，重组质粒命名为PET-28a/SP-C、PET-28a/SP-A。结论:将SP-C及SP-A基因成功克隆到表达质粒PET-28a中。
　　 第三步SP-C、SP-A的原核表达及纯化、鉴定
　　 目的:利用重组质粒表达SP-C及SP-A目的基因，合成目的蛋白SP-C及SP-A
　　 方法:分别将质粒PET28a与pET28a-SP-A/C转化至E.coliM15[pREP4]中，37℃培养过夜。次日以5％转接于LB培养基中，37℃培养2h后，取3ml菌液，测光吸收值A600;加入IPTG诱导1～5h后，分别收集菌体。表达产物用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。利用Ni-NTASlurry(agrose)方法进行纯化，取纯化后的蛋白收集物进行westernblot鉴定。
　　 结果:westernblot结果显示SP-C、SP-A重组蛋白均为单一印迹，无降解条带。
　　 结论:PET-28a/SP-C、PET-28a/SP-A在BL21中得到可溶性表达，且目的蛋白在表达过程中无降解。成功构建了肺表面活性物质相关蛋白C/A的原核表达载体，并表达了目的蛋白SP-C/SP-A。利用Ni-NTASlurry(agrose)方法进行纯化得到的蛋白纯度高。
　　 第四步:目的蛋白的抗原性检测
　　 方法:将目的蛋白SP-A及SP-C分别与佐剂混合后免疫健康的清洁级BALB/c小鼠各8只。检测阳性血清不同稀释倍数的抗体效价。
　　 结果:阴性对照组、不同稀释倍数组采用单因素方差分析，有显著统计学差异(SP-C(∶)F=271.417，P=0.000，SP-A(∶)F=218.345，P=0.000)，两两比较各稀释倍数组均与阴性对照组有显著统计学差异(P＜0.001)。
　　 结论:ELISA检测显示SP-A及SP-C免疫动物的阳性血清OD值大于阴性血清的2.1倍，具有良好的抗原性。

目录

摘要

前言

一、实验材料

1．1 材料

1．2 菌株和质粒来源

1．3 主要生化试剂及试剂盒

1．4 主要仪器设备

1．5 培养基和常用溶液的配制

二、实验方法

2．1 技术路线(如图：)

2．2 获取目的基因

2．3 T-A克隆

2．4 重组质粒提取与双酶切

2．5 PET-28a／SP-A、PET-28a／SP-C原核表达载体的构建

2．6 SP-A、SP-C的原核表达、纯化及检测

三、结果

四、讨论

参考文献

全文小结

综述

在读期间论文发表情况

致谢

声明

统计学审稿证明