8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞p16基因启动子DNA结合蛋白及其mRNA表达的影响

摘要

目的:应用Southwestern技术研究8-Br-cAMP和槲皮素(quercetin)对Eca-109细胞DNA结合蛋白与p16基因启动子区的结合调控mRNA表达的影响.方法:将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组:加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组:加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组:不加任何药物,只加入新培养液培养.同时培养48 h,应用质粒提取及限制性酶切回收目的DNA片段,采用生物素随机引物标记探针;应用DNA斑点印迹技术检测探针的灵敏度后以Southwestern印迹技术检测与p16基因启动子区特异性结合的DNA 结合蛋白(DBP);以原位杂交检测p16基因mRNA的表达情况.结果:实验组条带强于对照组,Br组强于Q组;核基质DNA结合蛋白主带位于Mr66 000、58 000和20 000;核外DNA结合蛋白主带位于Mr40 000、28 000和20 000;2者中20 000是共同成分.原位杂交技术显示p16基因mRNA蓝紫色信号颗粒位于胞质,杂交信号以实验组较强.结论:8-Br-cAMP和quercetin尤其是前者作用于人食管癌Eca-109细胞,诱导产生与p16基因启动子结合较强的DBP,启动p16基因表达.