人PTEN基因RNA干扰及其RESC救援慢病毒载体的构建与鉴定

摘要

目的:构建人PTEN基因RNA干扰(RNAi)及其逃避RNAi策略结构(RESC)救援的慢病毒载体.方法:利用Invitrogen公司在线软件,针对已筛选确定的PTEN基因RNAi有效靶序列,设计并合成靶序列的oligoDNA,退火形成双链DNA,与经Xba I和XhoⅡ酶切后的pFLRu-GFP载体连接构建成pFLRu-U6-shPTEN慢病毒载体.在此基础上,引入外源设计的PTEN mRNA,与经EcoR I和BamH I酶切后的pFLRu-U6-shPTEN载体连接,从而产生在同一个载体内兼有人PTEN基因shRNA及其救援cDNA同时表达的RESC慢病毒载体pFLRu-U6-rrshPTEN.2者均转入到大肠杆菌XL10感受态细胞,制备质粒并用酶切及测序鉴定.分别用pFLRu-U6-shPTEN、pFLRu-U6-rrshPTEN与pCMV-dR8.2ΔR和pCMV-VSV-G质粒共转染293/包装细胞,包装产生2种慢病毒,收集病毒上清,系列稀释法检测病毒悬液的滴度.结果:氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆、酶切鉴定、U6前引物测序鉴定结果显示pFLRu-U6-shPTEN和pFLRu-U6-rrshPTEN均为阳性克隆,且2种慢病毒的滴度分别为6.6 × 105和5.6 × 105pfu/mL.结论:成功构建出人PTEN基因RNAi及其RESC慢病毒载体.有效地避免了由于脱靶效应所引起的假阳性结果对实验的干扰,为研究PTEN基因功能提供了稳定的转染细胞载体.