微小根毛霉耐热α-淀粉酶基因的克隆与高效表达

摘要

[目的]开发具有高表达活力的耐热耐酸新型真菌α-淀粉酶,研究其酶学性质和催化活性,探讨其潜在工业应用潜力.[方法]采用RT-PCR从嗜热真菌微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)中克隆耐热α-淀粉酶基因,并命名为RpAmy.以质粒pPIC9K为表达载体,将α-淀粉酶基因(RpAmy)转入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达宿主KM71,进行异源表达,并测定动力学参数和酶学性质,分析水解淀粉的产物.[结果]克隆得到嗜热真菌微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)耐热α-淀粉酶基因,其开放阅读框全长1416 bp,编码471个氨基酸,与米根毛霉α-淀粉酶的氨基酸序列相似性最高(56.0％).RpAmy在毕赤酵母(Pichia pastoris)KM71中表达,最高酶活达到32100.0 U/mL,蛋白表达量为1.5 mg/mL;测定纯化后RpAmy比活力、Km和Vmax,分别为6745.9 U/mg、2.26 mg/mL、0.2875 mg/mL·min;最适pH和最适温度分别为pH 4.0、70℃;具有较宽的pH耐受性(4.0～9.0)和较高的温度耐受性(60℃);水解可溶性淀粉产物主要为麦芽糖(69.0％,w/w)和葡萄糖(22.0％,w/w).[结论]从微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)中克隆得到α-淀粉酶基因(RpAmy),其可在毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71中高效异源表达并得到α-淀粉酶RpAmy.该酶具有较好的耐酸耐热性质,并能水解淀粉产生高麦芽糖含量的糖浆,在工业应用方面具有很大的潜力.