免疫共沉淀法测定14-3-3ε蛋白与Cdc25B的相互作用

摘要

目的 研究14-3-3ε蛋白与Cdc25B的相互作用及其作用位点,为小鼠卵母细胞减数分裂G2期阻滞的机制研究提供实验依据. 方法 本实验依次构建pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε、pEGFP-Cdc25B-WT、pEGFP-Cdc25B-Ser321A、pEGFP-Cdc25B-Ser321D表达载体,分别转染HEK293细胞,分为四组,分别为Cdc25B-vector+ 14-3-3ε组(空载体组),Cdc25B-WT+14-3-3ε组,Cdc25B-Ser321A+14-3-3ε组,Cdc25B-Ser321D+ 14-3-3ε组.通过免疫共沉淀法获得各组细胞裂解液及免疫沉淀物,用Western blotting检测Cdc25B-vector、Cdc25B-WT、Cdc25B-Ser321A、Cdc25B-Ser321D与14-3-3ε蛋白是否有共沉淀,如有共沉淀,说明两蛋白存在相互作用. 结果 本实验构建的4种表达载体经验证均构建成功.免疫共沉淀实验得出14-3-3ε能与野生型Cdc25B结合,当Cdc25B的S321突变成S321A时,这种结合不发生;而具有模拟磷酸化作用的Cdc25B-S321D也能与14-3-3ε结合. 结论 Cdc25B S321是14-3-3ε蛋白与Cdc25B相互作用的特异性结合位点,此结合位点可能成为14-3-3ε蛋白与Cdc25B共同调控小鼠卵母细胞减数分裂进程及G2期阻滞的重要靶点,为后期哺乳动物生殖细胞的相关研究奠定实验基础.