昆明白小鼠胚胎生殖细胞的分离与培养

摘要

胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EG)是来源于原始生殖细胞(primordial germ cells,PGC)的多潜能干细胞.本研究旨在优化昆明白小鼠EG细胞的培养条件.以昆明白小鼠10.5 dpc胚胎PGC为材料,以丝裂霉素C处理的小鼠成纤维细胞(mouse embryonic germ cells,MEF)为饲养层,培养小鼠EG细胞,以对影响小鼠EG细胞传代的因素进行探讨.用ELISA试剂盒定量检测MEF自身分泌生长因子SCF、bFGF、LIF的浓度;以培养液是否添加生长因子,观察PGC/EG的培养效果;比较了机械分割法、胰酶消化法和胶原酶Ⅳ消化法对EG传代培养的影响;对获得的EG进行多能性鉴定.结果 表明,培养3d的饲养层上清液中含75.7 ng/L SCF、125.7 ng/LbFGF、196.6 ng/L LIF,培养5d的饲养层上清液中含76.2 ng/L SCF、136.2 ng/L bFGF、214.2 ng/L LIF;培养液添加生长因子显著提高了EG的克隆数、传代数(P＜0.05);机械分割法与酶消化法对EG传代差异显著(P＜0.05),而两种酶法对EG传代无显著影响(P＞0.05);所分离的EG细胞显示AKP染色强阳性;EG体外培养时会自分化为神经样细胞、上皮样细胞;EG细胞呈Oct4、SSEA 1的免疫荧光检测阳性.结果 提示,饲养层自身能分泌少量生长因子,但培养液中添加生长因子可显著改善昆明白小鼠EG培养效果,酶消化法更适合于昆明白小鼠EG的传代培养.