犬骨髓基质细胞矿化不同阶段对犬牙周膜干细胞增殖和分化的影响

摘要

目的 观察矿化不同阶段犬髂骨骨髓基质细胞（iliac bone marrow stromal cells,I-BMSCs）条件培养液对犬牙周膜干细胞（canine periodontal ligament stem cells,PDLSCs）增殖和分化的影响,为分析骨髓基质细胞调控牙周膜干细胞的生物学行为奠定基础。方法 体外培养犬骨髓基质细胞和流式细胞术分选纯化PDLSCs。取第三代PDLSCs,分别加入髂骨骨髓基质细胞矿化条件培养液（iliac bone marrow stromal cells conditioned medium,I-BMSCs-CM）行间接共培养PDLSCs。Control组：单纯的未诱导的PDLSCs,用含15%FBS的DMEM培养液常规培养;实验组为I-BMSCs-CM组、I-BMSCs-CM-10ds组、I-BMSCs-CM-15ds组。I-BMSCs-CM组：I-BMSCs诱导的PDLSCs;I-BMSCs-CM-10ds组：成骨诱导10 d的I-BMSCs诱导的PDLSCs;I-BMSCs-CM-15ds组：成骨诱导15 d的I-BMSCs诱导的PDLSCs。MTT法绘制细胞增殖曲线;qRT-PCR检测PDLSCs成骨分化相关基因的表达：特异AT序列结合蛋白2（special AT-rich sequence binding protein 2,Satb2）、核心结合因子2（runt-related transcription factor 2,Runx2）、骨钙素（osteocalcin,OCN）;Western blot检测Satb2、Runx2和OCN蛋白表达变化。结果PDLSCs呈长梭形,表达波形丝蛋白,具备成骨及脂向分化能力。生长曲线显示I-BMSCs能促进PDLSCs的增殖,I-BMSCs-CM-15ds促进PDLSCs增殖最为明显（F=342.8,P=0.017）。qRT-PCR和Western blot均能检测到PDLSCs的Satb2、Runx2和OCN的表达,第7天时实验组的PDLSCs的Satb2、Runx2和OCN的表达均高于对照组。I-BMSCs-CM-15ds上调PDLSCs的Satb2、Runx2、OCN蛋白表达最为显著,分别是Control组的3.04倍（FSatb2=24.48,P=0.014）、5.1倍（FRunx2=12.25,P 〈0.001）和3.67倍（FOCN=18.35,P=0.022）。结论 矿化程度较高的I-BMSCs更能促进PDLSCs增殖和向成骨样细胞分化,提示终末分化骨细胞可能诱发了PDLSCs的成骨分化。