MAPK和AKT磷酸化下调参与Toll样受体抑制的人牙周膜干细胞的成骨分化

摘要

目的:探讨Toll样受体(Toll like receptors,TLR)对人牙周膜干细胞成骨分化的影响及其可能的分子机制。方法:应用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)及流式细胞术检测TLR在人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs)上的表达。在成骨培养基中加入多种浓度的不同TLR配体培养7~14 d,检测TLR对h PDLSCs成骨的影响。通过Western blotting方法检测TLR配体刺激h PDLSCs 7 d后,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB or AKT)磷酸化水平的变化及runt相关转录因子2(runt related transcription factor 2,Runx2)的变化,并对比加入MAPK及AKT抑制剂后Runx2的变化,探究TLR是否通过影响下游的MAPK及AKT的活化而影响h PDLSCs的成骨分化。结果:TLR1、TLR3、TLR4、TLR6在h PDLSCs上表达较高,不同TLR的阳性细胞百分比为TLR1 2.82%±0.68%,TLR2 1.26%±0.09%,TLR3 13.23%±2.05%,TLR4 3.64%±0.79%,TLR6 3.21%±1.64%,其趋势与TLR在h PDLSCs中mRNA表达相一致。高浓度的TLR配体(Poly I:C 10 mg/L,LPS 10 mg/L,Pam3CSK4 1 mg/L,FSL-1 50μg/L)刺激h PDLSCs可减少矿化结节的形成,减弱ALP染色及降低ALP活性。高浓度TLR配体刺激还可下调细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)、P38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)及AKT的磷酸化水平,伴随Runx2的表达水平下调,应用MAPK及AKT抑制剂也可下调Runx2的表达。结论:高浓度的TLR配体刺激可抑制h PDLSCs的成骨分化,这种抑制作用和MAPK及AKT磷酸化降低相关。