奶山羊DDX3Y蛋白多克隆抗体的制备

摘要

[目的]制备针对奶山羊DDX3Y蛋白的特异性多克隆抗体,为奶山羊H-Y抗原蛋白DDX3Y的功能研究奠定基础.[方法]以奶山羊睾丸组织提取的RNA反转录所得的cDNA为模板,采用PCR方法扩增得到奶山羊DDX3Y基因CDs区全序列,测序后通过生物信息学方法比对分析确定DDX3Y蛋白N端1-120氨基酸及C端570-660氨基酸为抗原片段,然后用PCR分别克隆这2个片段的基因,最后利用搭桥PCR方法得到奶山羊DDX3Y截短抗原基因序列.将DDX3Y截短抗原基因序列连接pET32a(+)质粒,构建pET32a(+)-DDX3Y原核表达载体,将该载体导入到大肠杆菌BL21中诱导表达.通过Ni-NTA Resin纯化重组蛋白后免疫3月龄雌性新西兰大耳兔,采用间接ELISA(iELISA)法测定抗体效价,用Western blot测定抗体特异性.[结果]PCR扩增得到1 983 bp奶山羊DDX3Y基因CDs 区全长序列及CDs 区5'端360 bp(1-360 bp)序列和3'端273 bp(1 710-1 983 bp)序列.搭桥PCR获得了633 bp的DDX3Y截短抗原基因序列.成功构建了pET32a(+)-DDX3Y载体,并表达出分子质量约为42 ku的重组蛋白.制备出奶山羊DDX3Y截短抗原蛋白多克隆抗体,iELISA法检测抗体效价为1:105;Western blot检测表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别原核表达的奶山羊DDX3Y截短抗原蛋白以及公羊睾丸组织DDX3Y蛋白.[结论]成功制备出了奶山羊DDX3Y截短抗原蛋白多克隆抗体.