拟南芥PRL1多克隆抗体的制备及应用

摘要

[目的]制备拟南芥PRL1蛋白的多克隆抗体,并检测PRL1在拟南芥真叶中的积累情况.[方法]扩增拟南芥PRL1基因的CDS序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,转化到BL21 (DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PRL1重组蛋白进行镍柱亲和纯化.将制备的PRL1重组蛋白通过皮下注射免疫家兔,从抗血清中分离、纯化PRL1抗体.扩增拟南芥PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列,将其克隆至植物表达载体pBI111L中,再转化到农杆菌GV3101中,利用农杆菌侵染法构建prl1回复株系.利用纯化的抗体检测PRL1在野生型、prl1点突变体、PRL1 T-DNA插入突变体和prl1转基因回复系中蛋白积累量的差异.[结果]克隆了PRL1基因的CDS序列,成功构建了pET-28a-PRL1原核表达载体,实现了PRL1重组蛋白在大肠杆菌中的表达(包涵体).克隆了PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列,成功构建了pBI111 L-PPRL1-Strep-gPRL1植物表达载体及prl1回复株系.制备获得了PRL1重组蛋白的多克隆抗体,用该抗体能够有效地在拟南芥样品中检测出一条分子质量约为54 ku的蛋白,该蛋白在prl1点突变体中表达量下降,在PRL1 T-DNA插入突变体中缺失,而在prl1回复株系中表达量升高,并且在分裂旺盛的幼嫩组织中PRL1积累量较高.[结论]成功制备了PRL1蛋白的多克隆抗体,可用于拟南芥中PRL1蛋白含量的检测.