PCR产物液相杂交检测的优化

摘要

目的为了使液相杂交检测更加灵敏、特异、快速.方法通过改进杂交液的成分,选择最佳的探针浓度,使5′端标记生物素的PCR扩增产物与5′端标记地高辛的探针在PCR反应管中进行液相杂交,杂交条件为:94℃10 s冷却到37℃10 s即完成杂交.杂交后产物通过链霉亲和素被固定在微孔表面,同时在含高浓度DMSO的杂交液中将非特异结合的探针解离,然后对被固定的特异杂交产物进行ELISA检测.结果液相杂交的条件优化:杂交液中二甲基亚砜(DMSO)浓度为300ml@L-1,探针浓度为0.5μmol@L-1,杂交温度为37℃.对60～600 bp的PCR产物的杂交特异性无明显差异,可以检测到1×104copy的PCR产物,对100例乙型肝炎患者的血清进行检测,HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性率为100%(30/30);HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBc(+)的血清检出HBVDNA阳性率为78.6%(22/28);HBsAg(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性率为66.7%(16/24),其余为阴性.结论该液相杂交法操作简单、快速、灵敏、特异,适合临床实验室使用.