含有捕获探针的用于实时PCR的并可以通过杂交检测PCR产物而不需要打开PCR管的反应室

摘要

为含有PCR溶液(3)构造的用于实时PCR的反应室(1)，所述室具有捕获分子(4)和窗口(7)，捕获分子(4)固定于室内表面上，所述表面构造成与PCR溶液(3)间歇接触，窗口(7)通过位于室外的阅读器(6)可以检测来自所述内表面的信号，并且其中固定化的捕获分子(4)是没有标记的。

说明书

发明背景

1.发明领域

本发明涉及用于对固定化捕获分子进行核苷酸序列的聚合酶链反 应(PCR)及其检测的封闭装置。更特别地，该装置用于实时监控该序 列的扩增。本发明通过在一步测定中进行扩增和检测可以鉴定和定量 特定的基因或生物体。

2.相关技术的描述

使用核苷酸序列的分子扩增接着检测可最好地进行生物体或其一 部分如基因的检测和定量。通过几种最常见的方法来进行给定序列的 扩增，这些方法如聚合酶链反应(PCR)(美国专利4,683,195和 4,683,202)，连接酶链反应(LCR)(Wu和Wallace，Genomics，Vol. 4，p.560，1989)或循环探针反应(CPR)(美国专利5,011,769)。

PCR是最常用的扩增方法。PCR使用两个寡核苷酸引物，用于聚合 的试剂，靶核酸模板。核酸变性、退火和引物延伸的连续循环产生了 大量特定核酸片段的拷贝。使用最佳化条件时，可以将基因组DNA的 片段扩增高达10百万倍，并具有非常高的特异性和保真度。

通常在单个管中或在作为96孔或384孔平板形式的一部分的孔中 进行PCR，并且此后分析称为扩增子的扩增序列的存在。

检测PCR产物的方法描述于美国专利4,683,195中。这些方法需 要能够与扩增的靶核酸杂交的寡核苷酸探针。这些方法需要分开的扩 增、捕获和检测步骤，并且通常需要几个小时来完成。

由于PCR过程的大型扩增，来自含有高DNA含量的样品，或来自 之前扩增的小量的DNA遗留物可以产生非特异性的扩增子，甚至在不 存在有目的地添加的模板DNA的情况下。因为随着样品制备、处理和 分析所需要的操作步骤数量的增加，将杂质DNA引入样品中的可能性 增加，所以最小化用于其检测和定量的样品操作是优选的，特别是在 完成扩增反应后。

已经描述了用于同时扩增和检测靶核酸的方法和装置，目的在于 最小化样品污染的问题。

检测给定的靶核酸序列的存在，并且因此检测特定生物体存在的 一种特定方法是监控PCR循环过程中扩增子的出现。该方法称为实时 PCR。该方法给出了随着循环进行定量扩增序列和计算原始样品中该序 列的量的可能性。该方法使用同源形式，并且在一个管内进行PCR和 检测。在封闭的室中同时进行扩增和检测使由常规PCR后检测方法中 打开管子所引起的污染风险降低。

测定扩增子存在的一种方法是利用某些嵌入染料，当染料嵌入双 链DNA时，其荧光增加，或使其参数改变。一种最常用的染料是SYBR 绿。该方法用于测定双链DNA，主要是溶液中存在的扩增子的量。美 国专利4,683,195和美国专利6,171,785还使用了将可检测的DNA结 合剂(如溴化乙锭)引入扩增反应中，该试剂在PCR溶液中产生可检 测的信号，该信号在结合双链DNA时得到增强。PCR混合物荧光的增 强表示已经发生了扩增。为了有用，该扩增必须是非常特异性的，因 为非特异性扩增也会产生信号。

美国专利6,814,934也提出了用于实时检测溶液混合物中产生的 荧光增强的设备，该荧光增强是由PCR循环过程中双链扩增子的形成 所引起的。

迄今为止可利用的最好的PCR产物检测方法是基于使用扩增子的 特异性探针，其中当溶液中形成或存在该扩增子时，荧光发生改变或 被释放。美国专利4,683,195中描述了用于检测PCR产物的早期方法。 这些方法需要能够与扩增的靶核酸杂交的寡核苷酸探针。这些方法需 要分开的扩增、捕获和检测步骤，并且通常需要几个小时来完成。

已经研发了新的方法，包括分子信标探针，双染料寡核苷酸探针， Amplifluor或Scorpions引物和TaqMan探针。分子信标在结构上与 传统的单链杂交探针相似，除了信标的末端含有等长的自体互补片段， 其处于游离状态，将相互结合形成由平端茎干终止的环。茎干的末端 具有连接一侧的荧光剂，而猝灭剂连接另一侧，使得在未结合的状态 下自猝灭。当信标与靶扩增子连接时，荧光剂和猝灭剂在空间上变成 分开的，使得样品发出荧光。TaqMan探针是其中最通用的特定实时检 测方法并且可购得。TaqMan探针含有彼此接近的荧光剂和猝灭剂，这 抑制了与靶扩增子杂交的探针中或溶液中过量探针中的荧光。在扩增 子链通过具有5’-3’外切核酸酶活性的Taq聚合酶拷贝的过程中， 荧光染料通过探针的消化从猝灭剂的附近释放出来。它们在连续循环 过程中提供了累积于溶液中的可检测分子。

具有猝灭剂和荧光剂分子的线性(TaqMan探针)或发夹(分子信 标)探针的使用具有一些重要的缺陷。首先，探针对于合成而言是一 种复杂的分子并且是昂贵的。其次，对于每种待定量的扩增子需要不 同的荧光剂。该特征限制了相同测定中可能检测的扩增子数量。第三， 荧光剂和猝灭剂之间的距离对于游离探针的荧光剂的有效猝灭是关键 的。探针二级结构的存在可能影响荧光剂和猝灭剂之间的距离，并且 作为结果，游离探针没有得到正确地猝灭。

美国专利5,716,784提供了一种可替换的方法，该方法基于使用 两个互补的探针，第一个，在5’端用能量转移供体荧光团标记的分 析探针，第二个，在3’端用能量转移受体荧光团标记的检测探针。 溶液中与寡核苷酸检测探针杂交的寡核苷酸分析探针的定量检测提供 了靶核酸序列的扩增中耗尽的寡核苷酸分析探针的量的测量，并因此 提供了PCR复制程序中扩增的靶核酸序列的量的测量。分析探针的定 量检测涉及溶液中分光光度测量的能量转移检测。

美国专利5,928,907描述了用于实时监控核酸扩增反应产物形成 的装置，其使用了聚焦于样品体积中的光纤。通常通过管子或孔的尖 端或底部来检测溶液中的荧光。

尽管这些方法能够实时监控同源PCR杂交系统中的核酸定量，但 它们限于每种荧光染料中一种靶核酸的定量。由于检测仪必须能够检 测与溶液中的靶或标准品一样多的荧光染料，因此多重化不易实施。 这需要使用非重叠荧光染料，用于测量相同装置中几个单独的靶核酸 序列扩增相关的信号的增加。在大多数的应用中，使用一个荧光探针， 有时候两个。使用大量的探针将导致复杂性和检测系统成本的显著增 加，因为每个探针需要特定的激发和发射波长。

WO04/101733公开了用于直接基因检测的免洗PCR扩增管。将分 子信标固定于设计用于PCR目的的反应管内部。PCR管还包括透明的 窗口，在分子信标固定于PCR管内的地方。固定的探针包括荧光剂和 猝灭剂。将猝灭剂置于探针的游离端。在PCR过程中，在扩增子链通 过具有5’-3’外切核酸酶活性的Taq聚合酶拷贝的过程中，猝灭剂 通过固定化探针的消化从荧光剂的附近释放出来。它们在连续的循环 过程中提供了聚集于支持物上的可检测分子。

该方法与溶液中进行的实时PCR非常接近。在这两种情况下，扩 增步骤中都涉及探针颗粒。

分子信标作为捕获分子(固定于支持物上)的使用与溶液中所用 的分子信标相比较存在更多的缺陷。当对固体支持物附近的探针进行 PCR时，比在溶液中进行的PCR效率低得多而且更难以实施。当在相 同的支持物上使用多个分子信标如排列于微阵列中来定量不同靶时， 这种情况更加明显，因为探针与探针之间的基础荧光背景(没有靶) 是不同的。因此，不同靶的定量难以校准。

本发明的目的在于提供一种用于以下方法的装置，该方法具有使 用检测特异性探针的上述的实时PCR方法的优点，但是克服了以下缺 陷：每个测定只有单个(或非常少的几个)检测和/或同时具有特异性 和物理化学约束，如猝灭或FRET的标记探针设计的复杂性。

发明简述

本发明的目的在于提供用于在异源系统中实时监控PCR，避免与 现有技术方法相关的缺点的装置。该装置用于多种应用和待检测的靶， 并提供了实时监控大量靶序列的扩增的可能性。这又使得在单个测定 中检测和定量样品中多个生物体或基因的存在成为可能，并且不受荧 光染料数量的限制，如同在溶液中进行检测的实时PCR。

根据本发明的装置包括用于实时PCR的反应室，将其设计成用来 包含PCR溶液，所述室具有捕获分子和窗口，所述捕获分子固定于室 的内表面上，将所述表面设计成与PCR溶液间歇接触，窗口通过位于 室外的阅读器可以检测来自内表面的信号，并且其中固定化的捕获分 子是没有标记的。

通过在固定化捕获分子上扩增子的杂交赋予了检测的特异性。本 发明的另一个特征在于捕获分子不参加PCR反应，因此不干扰溶液中 发生的PCR。

附图简述

参考以下的附图将清楚本发明的特征和优点，其中：

图1是本发明优选装置的图示，该装置包括具有一个隔室的反应 室(1)。将装置用于以下的方法中。在步骤1中，将含有用于扩增和 标记的核苷酸分子和试剂的溶液(3)引入反应室(1)中。将捕获分 子(4)固定于反应室(1)的底部。在步骤2中，用盖子(2)将反应 室密封。在步骤3中，在反应室(1)中进行PCR扩增，反应室与温度 调节装置(5)接触。标记的靶分子存在于溶液中并在捕获分子(4) 上杂交。在步骤4中，将反应室(1)旋转，以便将携带捕获分子的表 面放置在检测器(6)的前面，并通过监测器(6)的窗口(7)来测量 结合的标记靶分子。

图2是本发明优选装置的图示，该装置包括具有一个隔室的反应 室(1)。将该装置用于以下方法中。在步骤1中，将含有用于扩增和 标记的核苷酸分子和试剂的溶液(3)引入反应室(1)中。在步骤2 中，用盖子(2)将反应室密封，盖子的表面上固定有捕获分子(4)。 在步骤3中，在反应室(1)中进行PCR扩增，反应室与温度调节装置 (5)接触。标记的靶分子存在于溶液中，并且与捕获分子(4)不存 在干扰。在步骤4中，将反应室(1)旋转，使得携带捕获分子的表面 与携带标记靶分子的溶液相接触。在该步骤过程中，标记的靶分子与 捕获分子(4)杂交。在步骤5中(其等同于图1的步骤4)，将反应 室(1)旋转，以便将携带捕获分子(4)的表面放置在检测器(6)的 前面，并通过监测器(6)的窗口(7)来测量结合的标记靶分子。

图3是本发明优选装置的图示，该装置包括具有两个隔室的反应 室(1)。该装置优选是盘状支持物的一部分，使得装置易于离心(图 3b)。图3a中呈现了其中使用该装置的方法的步骤。在步骤1中，将 含有用于扩增和标记的核苷酸分子和试剂的溶液(3)引入反应室(1) 中。将捕获分子(4)固定于反应室(1)的第二个隔室的顶端。在步 骤2中，用盖子(2)将反应室密封，并且在接触温度调节装置(5) 的反应室(1)的第一个隔室中进行PCR扩增。在步骤3中，将反应室 (1)离心并轻弹，以便使含有标记的靶分子的溶液接触固定于第二个 隔室中的捕获分子(4)。在步骤4中，将室(1)翻转回来，并且通 过检测器(6)通过窗口(7)测量结合的标记靶分子。

图4是本发明的可替换装置的图示，其包括具有两个隔室的反应 室(1)。装置的使用原理与图3中提供的相同。第一个隔室是微管， 而携带捕获分子(4)的第二个隔室是连接微管的扁平通道。

图5是本发明的优选装置的图示，其包括具有三个隔室的反应室 (1)：两个隔室由第三个隔室来分开，第三个隔室是带有捕获分子(4) 的通道。在步骤1中，将含有用于扩增和标记的核苷酸分子和试剂的 溶液(3)引入反应室(1)的第一个隔室中。溶液(3)通过毛细管作 用扩散至第二个和第三个隔室。在步骤2中，盖子(2)将第一个隔室 密封，并且在接触温度调节装置(5)的反应室(1)中进行PCR扩增。 在该步骤过程中，将溶液在捕获分子(4)上移动，以便提高捕获分子 上标记的靶核苷酸分子的结合反应速率。通过旋转，平移或上下移动 反应室(1)或通过升高-降低室内压力来实现这。在步骤3中，将反 应室(1)离心，以便从携带捕获分子(4)的表面除去含有标记靶分 子的溶液，并通过检测器(6)通过窗口(7)来测量结合的标记靶分 子。

说明性实施方案的描述

以下是本发明的某些实施方案的描述，仅通过实施例并参考附图 来给出。

定义。

术语“核酸”，“寡核苷酸”，“阵列”，“探针”，“靶核酸”， “基本上结合”，“与......特异性杂交”，“背景”和“定量”与国 际专利申请WO97/27317中所述的相同，在此引入作为参考。

术语“三磷酸核苷酸”，“核苷酸”和“引物序列”与文件WO00/72018 中所述的相同，在此引入作为参考。

术语“同源序列”和“共有序列”描述于欧洲专利申请WO01/77372 中，在此引入作为参考。术语“同源性”用来表示一个多核苷酸序列 与另一个多核苷酸序列的相同程度。两个或多个多核苷酸之间可能存 在完全的同源性(即，100％相同)。比对序列后计算同源性程度，并 可以通过本领域技术人员公知的任何方法来测定。

如在此所用的，“捕获分子”指的是能够特异性结合一个靶分子， 或一族靶分子，或多个靶分子中的一个或多个成员，或其一部分的分 子，或分子的复合物或组合物。捕获分子优选是核酸，在支持物表面 上原位化学合成或在外部合成并随后粘附于支持物上。通过两个多核 苷酸之间的碱基配对来实现核酸结合，一个核酸是固定的捕获分子， 而另一个是待检测的目标。捕获分子还包括核酸的衍生物，如PNA或 LNA，只要它们可以特异性结合目标多核苷酸分子。

术语“单一捕获分子物质”是用于通过碱基配对杂交或通过多肽 或蛋白质之间的分子识别来检测给定序列的相关多核苷酸的组合物。 通过化学或酶来合成多核苷酸，或从样品中分离，但是合成或分离不 总是合适的，捕获分子受到其他相关分子的污染，如更短的多核苷酸。 用于本发明的一个捕获物质的必需特征是全部物质可以用于捕获给定 的靶核苷酸分子。

在此所述的术语“与一个或多个基因或基因组序列互补的多核苷 酸序列”指的是能够在严谨条件下与所述基因或基因组或其拷贝的核 苷酸序列的至少一部分杂交的多核苷酸。多核苷酸还包括寡核苷酸(包 括多于2个但少于100个碱基)，其可以在特定条件下使用。这样的 可杂交多核苷酸通常在核苷酸水平呈现出与所述基因或基因组至少约 75％的序列同一性，优选与所述基因或基因组约80％或95％序列同一性， 或优选超过95％的核苷酸序列同一性。它们通常由15-30个碱基长的 小序列构成，或较长的为30至100个碱基，或甚至更长，为100至 800个碱基长，这取决于测定的特异性和灵敏度需求。

“微阵列”表示其上固定多个捕获分子的支持物，以便能够结合 给定的特异性靶分子。微阵列优选由位于表面上或支持物内或整个支 持物基底上特定的定位区域存在的捕获分子构成。特定的定位区域是 含有测定靶分子特异性的结合捕获分子的表面部分。特定的定位区域 是从构建微阵列中所用的方法可得知的，或是在检测过程中或之后限 定的。斑点就是特异性靶分子固定于捕获分子上并通过检测仪观察到 的区域。微阵列还可以含有标记的检测对照。这些对照检查检测的性 能和并围绕阵列，但是它们没有用于检测特异性靶分子。在本发明的 一个特定应用中，还在不同的支持物上提供了捕获分子的微阵列，至 少不同的支持物含有特异性捕获分子并可以相互区分出来，以便能够 定量特异性靶分子。使用具有特定特征并能够彼此区分出来的珠子混 合物就可以实现这，以便定量结合的分子。然后将一个珠子或一群珠 子认为是具有一个靶分子的特异性捕获分子的斑点。

本发明的“扩增子”意思是作为生物材料中存在的核苷酸分子的 PCR扩增结果的靶核苷酸分子。

“间歇接触”意思是物理接触或没有按照一定的期限。在本发明 的特定方面中，PCR溶液与捕获分子间歇接触，意思是从具有固定的 捕获分子表面除去或移去PCR溶液一定的时间段(没有接触)，然后 移回其最初的位置(接触)。优选除去或移去反应室中超过95％，并 优选超过99％的PCR溶液。优选通过由反应室的方向改变引起的自重 排泄来移去PCR溶液，优选由反应室的旋转，平移或侧移引起方向改 变。

优选实施方案的描述

有利地，根据本发明的反应室包含窗口，在其上固定了微阵列形 式的多个捕获分子，该微阵列具有至少4个不同的定位区域。

在优选的实施方案中，在合成过程中标记PCR循环过程中产生的 扩增子，并且结合固定于室表面的捕获分子时，可以通过反应室的窗 口来检测它们。

在另一个优选的实施方案中，用盖子将室密封，并且在35个PCR 循环后，室中存在的液体的蒸发小于10％，优选小于1％。

在另一个优选的实施方案中，反应室是由能抗90℃，优选抗95 ℃的固体材料制成的。

在另一个优选的实施方案中，将窗口的表面在高于85℃的温度下 维持平直，优选高于95℃。必须通过检测仪来检测杂交的扩增子，优 选如果结合相同含量的靶，含有不同捕获分子的定位区域必须显示出 相同的信号强度。因此，反应室的优选实施方案是具有小于100微米， 优选小于25微米的窗口不同检测定位区域的平直度公差的反应室。

在优选的实施方案中，在用于检测的波长处，窗口的透光率高于 80％，优选高于90％。

在另一个优选的实施方案中，通过窗口检测的由扩增子与固定的 捕获分子的结合引起的信号比没有结合(如不存在扩增子，或在没有 发生结合的情况下)而获得的信号高出至少2倍，优选至少5倍，更 优选至少10倍。

在优选的实施方案中，用位于室外的温度调节装置调节室温。温 度调节装置不在窗口位置，以允许测量结合的扩增子。

在优选的实施方案中，微阵列包括超过10个不同的捕获分子 (20)，优选超过20，更优选超过50。它们优选是多核苷酸分子。此 外，捕获分子优选具有扩增子特异性的结合序列(捕获部分)，和结 合室表面的间隔部分。固定的捕获分子优选是具有捕获部分和至少20 个核苷酸的间隔部分的多核苷酸，优选至少50，更优选超过90个核 苷酸。

在特定的实施方案中，将捕获分子固定于具有亚隔室的表面上。 优选，每个隔室含有不同的捕获分子。在另一个实施方案中，每个隔 室含有相同的捕获分子。更优选，该室包括在亚隔室中物理分开的至 少4个不同的捕获分子。

在一个特定的实施方案中，在PCR过程中，捕获分子不是流动地 接触含有扩增子的溶液。

在另一个实施方案中，在PCR过程中，捕获分子流动地接触含有 扩增子的溶液。

在优选的实施方案中，在液体不存在下，进行结合的标记扩增子 的测量。优选，通过自重排泄来获得液体的不存在，如通过改变反应 室的方向来实现。例如，通过选自以下的方法来改变反应室的方向： 反应室的旋转，平移或侧移。在特定的实施方案中，反应室具有两个 流动接触的隔室，一个用于PCR，而另一个含有用于检测结合扩增子 的窗口。

在另一个实施方案中，反应室具有三个流动接触的隔室，两个用 于PCR，而另一个含有用于检测结合扩增子的窗口。

在另一个优选的实施方案中，反应室(1)的至少一个隔室或室自 身具有选自以下的形状：管状，孔状，腔状或储存器形状。

更特别地，通过盖子密封反应室或反应室的隔室。优选，盖子作 为检测结合扩增子的窗口。根据本发明，盖子包括选自以下的材料或 由选自以下的材料制成：玻璃，金属，聚合物(优选具有低自体荧光 的耐热性)或微阵列技术中所用的任何其他材料(优选带有醛或环氧 化物或丙烯酸酯基团的活化玻璃)，所述盖子还包括特定的涂层，标 记或装置(条形码，电子装置等)，用于提高测定。

尽管玻璃存在许多优点(如，是惰性的并且具有低的自体荧光)， 也可以使用其他支持物，如聚合物，其在表面上具有各种化学上明确 的基团，使得核苷酸序列可以结合。在另一个优选的实施方案中，带 有捕获分子的支持物具有三维多孔结构。常规的载玻片在其表面含有 低于60％的二氧化硅。这固有地限制了表面上可用的化学结合量。多 孔材料呈现出提高的捕获分子的载荷容量。通常的多孔支持物包括凝 胶垫，熔融的纤维基质和纤维性聚合物基质。可以将捕获分子完全固 定于多孔材料中，或固定于平面如玻璃，塑料或金属之上的一层多孔 材料上。

除了玻璃以外，由于微流体技术和“芯片上的实验室”概念的发 展，逐渐提高了使用聚合物作为微阵列和生物测定小型化的支持物。 在优选的实施方案中，盖子的聚合物材料选自：聚碳酸酯(PC)，聚 乙烯(PE)，环烯共聚物(COC)，环烯聚合物(COP)或其混合物。 由于其卓越的光学特性，耐化学性，热稳定性和低荧光性，优选的COP 产品是Zeonex。在优选的实施方案中，盖子是耐热性的并且在高于 85℃的温度维持平直。在另一个优选的实施方案中，在用于检测的波 长处，盖子的透光率高于80％，甚至高于90％。

在特定的实施方案中，反应室或该室的是多孔平板的孔，通过 4.5mm或其倍数的孔距相互分开。优选，反应室或该室的隔室是支持 物的一部分，该支持物是具有至少2个室，优选至少8个，更优选至 少24个，再更优选至少96个，更优选至少384个室的多孔平板。

在优选的实施方案中，室由选自以下的聚合物制得：聚碳酸酯 (PC)，聚乙烯(PE)，环烯共聚物(COC)，环烯聚合物(COP)或 其混合物。优选，环烯共聚物(COC)或环烯聚合物(COP)是Zeonex产品。在优选的实施方案中，室和/或窗口由Zeonex制得，其具有高 于90％的透光率(http://www.zeonchemicals.com)。

在优选的实施方案中，用作捕获分子的多核苷酸为10至1000个 核苷酸长，优选100至400个核苷酸长。对于相同样品中可能存在的 同源序列的特异性结合，多核苷酸捕获分子含有根据专利WO0177372 的间隔部分。使用具有10至30个核苷酸的特异性部分捕获分子获得 相同样品中可能存在的同源序列或SNP的特异性结合。

在优选的实施方案中，用作捕获分子的多核苷酸存在于定位区域 的微阵列上，以高于10fmole/cm²的密度，优选高于100fmole/cm²固体支持物表面。

根据本发明的微阵列含有4至100000斑点/cm²，优选20至1000 斑点/cm²。每个斑点优选是用于一个捕获分子的定位区域。小型化使 得可以在大量表面斑点(通常为约0.1至约1mm直径的圆形斑点)上 进行一个测定。可以使用0.2至0.4mm直径的大头针低成本地容易地 获得含有20至400个斑点的低密度阵列。通过减小斑点的大小，例如 0.1mm至0.2mm直径，来获得高达1,600个斑点/cm²的较高密度斑点。 早先在US5,445,934中已经描述了获得较高密度捕获分子的方法。斑 点大小的小型化使得可以同时获得并分析大量的数据，可以进行重复 并且测定只需要少量的生物样品。用于微阵列上检测的小型化优选与 用于从细胞提取物中分离，提取核苷酸分子的微流体底物相关。

在优选的实施方案中，定位区域包括约10μm²至约1mm²，优选约 1μm²至约100μm²。

在一个优选的实施方案中，微阵列上存在的捕获分子与溶液中存 在的扩增靶核苷酸序列的至少一部分互补。捕获分子包括能够特异性 结合扩增的靶核苷酸序列的核苷酸序列，还优选通过至少约6.8nm或 20个双链形式的核苷酸的间隔臂(间隔部分)将所述特异性核苷酸序 列(捕获部分)与固体支持物分开，间隔臂对于扩增的靶分子没有结 合亲和性。在优选的实施方案中，捕获分子是单链多核苷酸，其含有 能够特异性结合标记的靶核苷酸分子的捕获部分，和至少20个核苷酸 的间隔部分，优选超过90个核苷酸。间隔部分可以是单链或双链DNA。

在优选的实施方案中，捕获分子由15至100个核苷酸构成，更优 选15至35个核苷酸。

适用于本发明中的可检测标记包括通过电磁光发射可以检测的任 何组合物。在一个实施方案中，用荧光染料标记靶分子。可以通过酶 或化学反应将荧光标记引入靶中。典型的酶反应包括将核苷酸类似物 引入靶中。或者，可以将在5’端用荧光染料标记的引物引入靶中。 还可以通过化学反应将荧光染料引入靶中，如带有N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)基团的荧光染料与靶的胺基的反应。本发明中有用的荧光染料 包括花青染料(Cy3，Cy5，Cy7)，荧光素，得克萨斯红，若丹明，绿 色荧光蛋白。优选，用于花青苷3的激发波长包括540至558nm，550nm 处为峰值，发射波长包括562至580nm，570nm处为峰值。

优选，用于花青苷5的激发波长包括639至659nm，649nm处为峰 值，而发射波长包括665至685nm，670nm处为峰值。优选，用于花青 苷7的激发波长包括733至753nm，743nm处为峰值，而发射波长包括 757至777nm，767nm处为峰值。

教导了使用这样的标记的专利包括美国专利3,817,837； 3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和 4,366,241。在优选的实施方案中，荧光染料是花青苷3，花青苷5或 花青苷7。

在扩增之前，最初的核苷酸分子不必定要标记，但是在扩增步骤 中应当形成扩增的标记靶分子。

在变性步骤后，扩增的核苷酸分子能够在捕获分子上杂交。因为 扩增的核苷酸分子是双链的，在理论上它们应当在溶液中重新聚集， 比它们在固定于固体支持物上的捕获分子上杂交快得多，其中扩散低 且特异性结合序列短，因此降低了更多的反应速率。因此，不希望在 短期孵育后观察到随着多个热循环在捕获分子上显著的信号增强。

在特定的实施方案中，对结合的目标标记分子进行测量，同时它 们在热循环的退火和/或延伸过程中以双链形式在溶液中重新聚集。

有利地，扩增的靶核酸分子的长度是有限的，优选100至2000 个碱基，更优选200至1500个碱基，再更优选300至800个碱基。这 种优选的需求取决于发现扩增样品可能存在的所需序列的引物的可能 性。靶太长可以更快地再分配并采用二级结构，这抑制了捕获分子上 的固定。

对热循环仪进行改变以适合96孔微量滴定平板的支持物格式。优 选使用珀耳帖元件或脉冲空气获得交替的加热和冷却。

在优选的实施方案中，光束是激光束，其聚焦于盖子隔室的表面 上，以便直接激发荧光分子。激光束优选垂直聚焦于盖子的表面。以 激发激光束相对的方向检测发射光。优选作为共焦光来检测发射光， 并在扩增后通过光电倍增管来检测。在优选的实施方案中，通过激光 束扫描盖子隔室的表面，以便获得结合靶的最大光发射。

在优选的实施方案中，定量与盖子隔室上的捕获分子相关的信号。 优选的方法是用扫描仪扫描阵列，优选是共焦扫描仪，用于检测荧光 标记的靶的激光。图像的分辨率包括1至500μm，优选5至50μm。

优选扫描窗口隔室，随后测量微阵列的每个定位区域或每个亚隔 室。优选，在1分钟内进行阵列的扫描，更优选在30秒内，再更优选 在10秒内。如果在多个热循环重复阅读，优选在温度步骤的相同精确 瞬间测量每个定位区域的扫描。

随后测量每个定位区域的情况可以有利地用于监控固定于支持物 不同定位区域的相同捕获分子上的标记靶核苷酸分子的杂交动力学， 以时间依赖性方式来扫描这。因为在测量过程中维持温度恒定，靶核 苷酸分子在扫描过程中持续在捕获分子上杂交。

在特定的实施方案中，将不同PCR循环中进行的扩增靶分子的定 量数据进行处理，以便在扩增前定量最初溶液中存在的核苷酸分子的 含量。当扩增效率最大时，扩增循环导致每个循环中目标序列的倍增。 从给出可检测值的第一个循环的外推或从与固定极限交叉的值计算最 初核苷酸浓度的定量。然后从参照曲线，或从标准分子获得的数据计 算浓度。

在优选的实施方案中，处理数据以便获得每个定位区域的信号值。 在另一个实施方案中，处理数据以便获得每个定位区域和局部背景的 信号值。通过从每个定位区域的信号值减去背景来进一步处理数据。

在优选的实施方案中，通过比较定位区域的信号值与固定的值来 进行核苷酸分子含量的定量。

在可替换的实施方案中，通过比较到达固定值(循环极限或CT) 需要的热循环数量与参照核苷酸分子的CT来进行核苷酸分子含量的 定量。优选在相同溶液中扩增参照核苷酸分子并在相同微阵列上作为 靶核苷酸分子来检测。

在另一个实施方案中，通过比较达到固定值需要的热循环数量 (CT)与标准曲线来进行核苷酸分子含量的定量，在曲线中将CT相对 标准浓度来作图。

以下呈现了本发明的一个实施例，该实施例适于从最初的核苷酸 分子测量扩增靶的测定。

实施例

实施例1.用醛基激活的96孔平板的制备

为了醛基的存在，根据以下的实验方案将Zeonex中具有96孔的 多孔平板功能化。

1.胺化多孔平板的制备

通过氨等离子体处理将伯胺功能引入由COC Zeonex 330R制得的 多孔平板的孔中。

通过NH₃等离子体中的常规低压射频(rf)等离子体放电来进行 表面修饰。将多孔平板置于托盘上，然后将托盘放入室中。电极具有 和托盘一样的大小，使得样品得到均匀的覆盖和处理。电极和样品之 间的距离为8cm。将样品引入反应室中(W305mm，H300mm，L370mm) 并抽气至8×10^-2毫巴(真空泵：Leybold，型号D16B)，开始气流并 进行等离子体放电(工作压力0.3毫巴，40kHz，30％功率的发电机； 放电时间5分钟)。

2.葡聚糖聚醛的制备

将2.5g葡聚糖(分子量70000；Aldrich n°D1537)溶解于50ml 蒸馏水中，然后加入3.594g高碘酸钾(15.6mmol；Aldrichn° 322423)。将制剂在黑暗中室温下剧烈振荡14h，并在4℃下渗析3 天(截留量10000；3次1升蒸馏水)。将溶液离心并冻干。获得2.15g 葡聚糖聚醛(产量：86％)，将其储存在室温直至使用。

将0.125g葡聚糖聚醛溶解于12.5ml 0.1M pH6的磷酸盐缓冲液中。 将混合物在剧烈搅拌下在60℃加热几分钟直至完全溶解(终溶液1％)。 在使用前，将该溶液冷却至室温。

3.醛多孔平板的制备

将70μl步骤2中获得的葡聚糖醛溶液加入带有氨基的多孔平板 的每个孔中。用盖子将平板盖住并在室温孵育2小时，然后用蒸馏水 洗涤3次。将多孔平板存储于真空下直至使用。

实施例2.固定于多孔平板上的捕获分子

为了醛的存在，根据实施例1中所述的方法将Zeonex中具有96 孔的多孔平板功能化。然后将胺化的DNA以微阵列模式点入用醛基衍 化的96孔平板的孔中。以3μM的浓度从溶液中点出胺化捕获分子。 使用开口别针(n°1545 Genetix Limited)将捕获分子印在孔上。点 样后，用0.2％SDS将孔洗涤一次，历时1分钟，用蒸馏水洗涤两次。 然后用NaBH₄溶液(2.5mg/ml PBS 75％/乙醇25％)将孔孵育5分钟， 用蒸馏水洗涤两次并干燥。将96孔平板储存于4℃真空下。所获得的 96孔平板中的一个孔表示图1中本发明优选的装置。

因此，通过参考上述的某些实施方案描述了本发明。将认识到本 领域技术人员公知可以容易地获得这些实施方案的各种改进和替换形 式。

可以对在此所述的结构和技术进行除了上述那些以外的许多改变 而不脱离本发明的精神和范围。因此，尽管已经描述了特定的实施方 案，但这些只是实施例并非限制本发明的范围。