乙型肝炎病毒重组酶聚合酶等温扩增闭管可视化检测方法及装置

摘要

目的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的传统检测方法因操作繁琐等因素,不适于现场快速检测。以乙型肝炎病毒(HBV)核酸检测为例,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增技术(RPA)的HBV核酸等温扩增检测方法并设计了配套的RPA产物可视化检测装置。方法首先设计了可用手机拍照采集图像并经肉眼可视化判读检测结果的RPA产物检测装置;然后根据HBV基因保守序列设计RPA引物及探针,通过监测RPA反应的实时荧光曲线来比较各引物对的扩增效率来筛选最佳引物对并优化最适的反应条件,采用人工合成的HBV靶标质粒考察可视化检测的灵敏度,并通过检测人工合成的包含丙肝病毒、人免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体、流感病毒、人乳头瘤病毒核酸片段的质粒来考察了方法的特异性;通过与实时荧光扩增曲线进行对比,验证了RPA产物可视化检测装置的可行性;最终对20份经实时荧光PCR检测过的血清DNA样本进行RPA可视化检测来评价方法对临床实际样本检测的适用性。结果采用RPA产物可视化检测装置实现了手机拍照肉眼观察即可判定检测结果的阴阳性信号,HBV核酸RPA扩增可视化检测方法可在39℃30 min内实现对低至1-10拷贝HBV DNA靶标的可视化检测,并且特异性良好;对20份血清DNA样本检测的结果与市售qPCR试剂盒的检测结果完全一致,初步验证了方法及装置的实用性。结论基于建立的HBV-RPA扩增体系,结合配套设计的RPA产物可视化检测装置,有望开发出低成本血液HBV核酸现场快速可视化筛查技术平台。