柯萨奇病毒B4双siRNA表达载体的构建及表达

摘要

目的:构建以柯萨奇病毒B4的1A和2A基因为靶基因并带有绿色荧光蛋白标志的可表达发夹结构的双链siRNA的表达载体pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A.方法:选择柯萨奇病毒B4的1A和2A区基因21 bp为靶序列分别合成65 bp的互补片段并克隆到pSilencer2.1U6 Neo和pGCsi-U6/Neo/GFP质粒中,经限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳分离、回收DNA片段,及连接酶连接构建双siRNA表达质粒pU6/doublesiRNA/Neo/GFP/1A/2A;将构建的载体转染Hela细胞后,荧光显微镜观察荧光的表达.结果:限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A,有正确的特异性片段,DNA测序也证明其具有正确序列;将该重组质粒转染入Hela细胞后,重组质粒构建成功并在真核细胞内表达GFP,表达时间可达15 d以上.结论:针对柯萨奇病毒B4的1A和2A基因的双siRNA表达载体pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A构建成功,并可在真核细胞内持续表达15 d以上.