靶向PTTG和survivin双干扰siRNA表达载体的构建及鉴定

摘要

目的:构建同时干扰人垂体瘤转化基因(PTTG)和生存素(survivin)基因表达的RNA共干扰载体,并检测其对人脑胶质瘤U251细胞中PTTG基因和survivin基因的干扰作用.方法:根据GenBank数据库中PTTG和survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰PTTG和生存素基因的重组干扰质粒pGenesil-2.1-PTTG siRNA和pGenesil-2.1-survivin siRNA.酶切、测序鉴定正确后,将pGenesil-2.1-Survivin和pGenesil-2.1-PTTG质粒分别进行HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切,1％琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒survivin双酶切大片段和质粒PTTG双酶切小片段(约380 bp),将质粒survivin回收大片段与质粒PTTG回收小片段进行连接,得到双干扰质粒pGenesil-2.1-PTTG-survivin siRNA,酶切鉴定,同时检测其对U251细胞PTTG和survivin基因mRNA表达的干扰作用.结果:测序和酶切鉴定结果显示,pGenesill-PTTG、pGenesill- survivin和双干扰质粒pGenesil2.1-PTTG-survivin siRNA构建正确；RT-PCR结果显示,将双干扰质粒转染U251细胞48 h后,U251细胞中PTTG基因和survivin基因mRNA表达明显降低.结论:成功构建了能同时干扰PTTG和survivin基因的双干扰pGenesill-PTTG-Survivin siRNA表达载体,并可有效抑制U251细胞PTTG和srvivin基因mRNA的表达.