吡虫啉单克隆抗体的制备及其间接竞争化学发光酶联免疫分析方法的建立

摘要

以吡虫啉原药和3-巯基丙酸为原料,合成了吡虫啉半抗原,通过活泼酯法将其与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)偶联制备得到完全抗原,经免疫Balb/c雌性小鼠并与骨髓瘤细胞融合获得吡虫啉单克隆抗体,建立了用于吡虫啉检测的间接竞争化学发光酶联免疫分析方法(ic-CLEIA).优化了方法的包被原稀释倍数、抗体稀释倍数、缓冲液种类、缓冲液的pH值、一抗竞争反应时间、酶标二抗稀释倍数等条件,最适条件为:包被原质量浓度62.50 ng/mL(稀释16000倍),抗体质量浓度103.12 ng/mL(稀释64000倍),缓冲液PBS(pH 7.4),抗原与抗体竞争反应时间30 min,酶标二抗稀释倍数1:7000.结果表明,在最适条件下该方法的检出限(IC10)为0.03 ng/mL,IC50为0.57 ng/mL,线性检测范围(IC20～IC80)为0.083～3.99 ng/mL.与氯噻啉的交叉反应率为2.2％,与噻虫胺、呋虫胺、啶虫脒、噻虫啉、噻虫嗪5种吡虫啉结构类似物无明显交叉反应.对黄瓜和苹果样品的加标回收率为82.0％～112％,相对标准偏差小于15％.实际样品检测结果与HPLC仪器方法相关性良好(r2=0.989).结果表明,所建立的ic-CLEIA方法具有特异性强、灵敏度高的特点,可用于食品中吡虫啉残留的快速检测.