绵羊成肌细胞的纯化、培养、鉴定及其成肌诱导分化研究

摘要

为建立绵羊成肌细胞体外纯化、培养和鉴定的方法以及对成肌细胞进行成肌诱导分化的初步研究,本试验以绵羊胎儿为材料,采用胶原蛋白酶ⅠA消化分离成肌细胞,分别用Percoll分离液梯度离心和2次差速贴壁法纯化成肌细胞,采用免疫荧光方法检测成肌细胞的特异性标志蛋白Desmin以及RT-PCR鉴定成肌细胞的定型因子My f5和MyoD1.细胞传至第二代后用CCK-8试剂盒检测细胞生长曲线.利用含2％马血清的培养基进行分化诱导并进行MYH1(Myosin heavy chain 1肌球蛋白重链1)免疫荧光染色.结果显示,梯度离心和差速贴壁法均可获得较高纯度的成肌细胞,纯度均在92％以上.RT-PCR结果显示细胞高表达Myf5和MyoD1.细胞符合正常生长规律,生长曲线近似S形.对成肌细胞进行诱导分化,大部分细胞融合为肌管,成肌特异性标志MYH1表达呈阳性.本研究获得了绵羊成肌细胞分离纯化培养及鉴定的方法、高纯度的绵羊成肌细胞系,为以后利用成肌细胞研究肌肉发育调控机理提供了材料.