携带CBP短发夹RNA基因腺病毒表达载体的构建

摘要

目的:构建编码4条大鼠CREB结合蛋白(rCBP)短发夹RNA(shRNA)的腺病毒,检测RNA干扰技术(RNAi)下调rCBP mRNA的能力.方法:根据RNAi原理,设计4条针对rCBP的shRNA序列.PCR技术和酶切连接技术构建重组穿梭质粒Pgenesil4-rCBP-EGFP;体外同源重组技术构建可同时编码4条rCBP shRNA的腺病毒(CBP-shRNA/Ad),并进行鉴定和滴度检测.荧光显微镜观察CBP-shRNA/Ad转染大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)效率,RT-PCR技术和实时定量PCR技术检测CBP-shRNA/Ad下调rCBP mRNA的能力.结果:经酶切鉴定和质粒测序证实CBP-shRNA/Ad构建成功.荧光显微镜下观察,感染复数为25的CBP-shRNA/Ad转染VSMCs效率达80%,并且细胞生长良好.相同剂量的CBP-shRNA/Ad转染VSMCs 24 h、48 h、72 h,rCBP mRNA含量持续下降(P＜0.05),并且72 h时rCBP mRNA含量低于空白对照组(P＜0.05).结论:CBP-shRNA/Ad可明显下调rCBP mRNA含量,对VSMCs无明显毒副作用,为基因治疗血管增殖性疾病奠定初步实验基础.