人Mirk基因短发夹RNA慢病毒Tet-on表达载体构建与RNA干扰效率的鉴定

摘要

目的：构建人Mirk基因的短发夹RNA(shRNA)慢病毒Tet-on表达载体并在横纹肌肉瘤RD细胞上鉴定其沉默效率。
　　方法：设计合成靶向人Mirk基因的shRNA序列,构建于慢病毒pTRIPZ表达载体,克隆筛选出有效shRNA慢病毒载体,重组质粒经双酶切和DNA测序。重组质粒与包装质粒在293T细胞中磷酸钙共沉淀法包装成病毒颗粒,,然后感染横纹肌肉瘤RD细胞,DOX诱导RNA干扰,普通PCR方法检测mRNA水平靶基因的沉默效率。
　　结果：构建TRIPZ-Mirk-shRNA的酶切鉴定和测序正确,包装病毒后滴度达到5x10p6TU/ml。shRNA慢病毒颗粒感染横纹肌肉瘤RD细胞后在DOX诱导下Mirk基因的mRNA表达量较阴性对照组明显下降,差异有统计学意义。
　　结论：成功构建靶向人Mirk基因的shRNA慢病毒Tet-on表达载体,DOX诱导下该载体能够在核酸水平有效沉默靶基因。

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前言

材料与方法

一实验试剂与仪器

二 实验方法与步骤

1.1 细胞培养

1.2 Mirk-shRNA的设计

1.3 质粒(pTRIPZ空载)小提

1.4 质粒双酶切线性化

1.5 寡核苷酸DNA链的退火

1.6 双链DNA的双酶切

1.7 连接

1.8 转化感受态DH5a

1.9 慢病毒的包装

2.0 慢病毒感染RD细胞

2.1 提取总RNA

2.2 RT-PCR

2.3 琼脂糖凝胶电泳

2.4 统计学处理

结果

1 Mirk-shRNA序列设计及siRNA Blast结果

2重组质粒克隆筛选结果

3 四种pTRIPZ-Mirk-shRNA重组质粒双酶切鉴定及DNA测序结果

4 重组慢病毒质粒的包装及病毒滴度测定结果

5 筛选慢病毒感染RD细胞的稳定表达株

6 强力霉素诱导RD稳定细胞株表达Mirk-shRNA

7 重组慢病毒感染RD稳定细胞株Mirk基因的mRNA表达情况(图13及图14)

讨论

参考文献

综述