基于细胞融合开发双基因共敲除技术

摘要

基因编码工具(例如CRISPR/Cas9)的出现使敲除哺乳动物细胞基因成为现实.然而,实现细胞的多基因敲除成功率低且所需时间长.细胞融合技术是构建杂合细胞的常用方法,通过融合两种不同表型的细胞,构建出一种具有杂合表型的新型细胞.但是,由于基因的互补作用,通过基因敲除而获得的性状在细胞融合后成为隐性性状,融合细胞不能表现该性状.本研究的目的是设计一种通过细胞融合技术和CRISPR/Cas9技术获得基因双敲除细胞的方法.由于现阶段没有关于HEK 293细胞株细胞融合的参考数据,所以首先在HEK 293野生型细胞株中分别敲除GPI生物合成必需的PIGA或PIGK,获得PIGA-KO细胞株和PIGK-KO细胞株,并以这两个细胞株作为模型进行条件优化.经过反应条件优化,HEK 293细胞的融合效率显著提高,且实现了FUT8敲除细胞株和ST6GALJ敲除细胞株的快速融合;其次是将细胞融合技术与CRISPR/Cas9技术结合从而实现多种糖基因的快速敲除.将分别含有FUT8和ST6GAL1目标导向RNAs且都能稳定表达Cas9蛋白的两个细胞株进行融合,即可获得FUT8和ST6GAL1基因都被敲除的双敲细胞株.实验结果表明,将细胞融合技术和CRISPR/Cas9技术结合可简便而快速地获得基因双敲除细胞株.