重组变异体二氢叶酸还原酶和绿色荧光蛋白腺相关病毒载体的构建及外源基因表达

摘要

构建携带变异体二氢叶酸还原酶(mDHFR)和绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的重组腺相关病毒(AAV)载体,并使其在NIH3T3细胞中表达,观察NIH3T3细胞的耐药性变化.先分别扩增mDHFR和GFP基因片段,并用甘氨酸接头以PCR的方法将其连接在一起,插入T载体,酶切后插入AAV载体,包装成病毒后感染NIH3T3细胞,通过PCR、荧光显微镜和流式细胞术对融合基因的表达进行观察.结果:PCR检测到NIH3T3细胞DNA基因组中mDHFR和GFP cDNA,荧光显微镜和流式细胞仪观察到绿色荧光蛋白表达的比率约为25%,MTT法检测转基因组对MTX的耐药性增强.结论:AAV载体可以将mDHFR和GFP融合基因导入NIH3T3细胞并成功表达,使其对MTX的耐药性增强,为mDHFR基因和AAV载体在基因治疗中的应用提供了理论依据.