筛选丙型肝炎病毒1b型非结构蛋白4B慢病毒LO2稳定株差异表达基因和基因通路

摘要

目的:筛选表达丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV) 1b型非结构蛋白4B(nonstructural protein 4B,NS4B)的慢病毒稳定细胞株L02-NS4B差异表达基因和基因通路,为深入研究HCV NS4B在慢性丙型肝炎和肝细胞癌发生中的作用及机制提供依据.方法:将已构建好的2株慢病毒稳定细胞株LO2-NS4B和阴性对照慢病毒稳定细胞株LO2-mkate2复苏扩增;应用Human Gene 1.0ST芯片筛选出LO2-NS4B与LO2-mkate2差异表达基因.基于京都基因和基因组百科全书(kyotoencyclopedia of genes and genomes,KEGG)数据库,利用Fisher精确检验和卡方检验,对差异基因参与的信号转导通路进行显著性分析.应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time QPCR)方法验证基因芯片中5个表达上调且与凋亡有关的基因,即蛋白激酶Cδ结合蛋白(protein kinaseC delta binding protein,PRKCDBP)基因、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)基因、v-akt鼠科胸腺瘤病毒癌基因同源物Ⅰ(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1,AKT1)基因、含3个杆状病毒凋亡蛋白抑制因子重复序列(baculoviral IAP repeat containing 3,BIRC3)基因和B细胞淋巴瘤2样1基因(B-cell lymphoma 2-like1,BCL2L1)的mRNA水平.结果:以LO2-NS4B与LO2-rnkate2之间基因荧光强度的比值大于1.2或小于0.8为差异表达基因,在已知的28 869个人类基因中L02-NS4B中有2 682个差异表达基因,包括1 446个基因表达上调和1 236个基因表达下调.上调基因参与的显著性信号转导通路41项,主要有凋亡通路、细胞外基质受体相互作用通路、细胞周期通路、癌症通路和Toll样受体信号通路等;下调基因参与的显著性信号转导通路20项,主要有癌症通路、Wnt信号通路和细胞周期通路等.Real-time QPCR验证5个表达上调基因中有3个基因表达变化与基因芯片结果一致,分别是AKT1,BIRC3和BCL2L1,吻合率为60％.结论:HCV NS4B可以调节LO2细胞中与细胞凋亡、细胞周期和细胞增殖等有关的多种基因表达,主要影响与细胞凋亡、细胞周期和癌症相关的信号转导通路.