筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白4B转染细胞差异表达基因

摘要

目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达基因,进一步阐明NS4B蛋白在丙型肝炎慢性化及致细胞发生发展过程中的分子生物学机制方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成HCVNS4B基因序列特异性的引物,以含有HV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS4B蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的HCVNS4B编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS4B.以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系.HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体:pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行.DNA芯片分析.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Westernblot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有NS4B蛋白的表达,提取高质量的mRNA并逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,发现有22个基因表达水平显著上调,34个基因表达水平显著下调.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HCVNS4B转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明NS4B蛋白致病的分子生物学机制提供依据.