TaqMan 实时荧光定量RT-PCR检测变异剪接体

摘要

目的:建立应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术对基因mRNA的各个变异剪接体分别进行定量检测的技术.方法:以对ERCCI的变异剪接体进行检测为例.使用TRIzol裂解新鲜手术切除的卵巢癌组织后提取总RNA,逆转录为eDNA后,PCR扩增ERCCI基因以及beta-actin基因,琼脂糖电泳分离PCR产物,纯化后连接到pMD18-T载体,转化人感受态大肠杆菌,提取并纯化质粒,稀释成不同浓度作为标准品以便制作标准曲线.结果:成功构建了缺失第Ⅷ外显子的ERCCI质粒以及beta-actin质粒,设计了两套针针对ERCCI的TaqMan探针和引物,建立了稳定的定量检测EBCCI mRNA变异剪接体表达水平的平台.结论:TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法可以成功地分别对基因的变异剪接定体进行定量检测.