苹果内参基因的筛选及三种潜隐性病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

摘要

病毒病严重影响苹果的生长、产量以及果品质量，尚无有效防治药剂，树体一旦侵染很难根除，繁育无病毒苗木实行无毒化栽培是其防治的最有效途径。高效、灵敏、稳定的病毒检测技术是实现苹果无毒化栽培的重要技术保障之一。本研究在筛选出适用于苹果的内参基因的基础上，分别建立了苹果Actin基因及苹果茎沟病毒、茎痘病毒、褪绿叶斑病毒三种苹果潜隐性病毒的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法，旨在为进一步研究三种潜隐性病毒的侵染、增殖、分布以及时序变化等规律提供有效的技术手段，并为苹果病毒的多重实时荧光定量RT-PCR检测体系的研发奠定基础。主要研究结果如下：
　　1、本研究采用SYB GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术，对Actin、TUB、GAPDH、18SrRNA、UBQ、nad5六个持家基因在苹果幼叶、成龄叶、枝皮、根皮和种子中的表达量进行了检测。经GeNorm软件分析发现，6个内参基因在五种不同组织器官中的表达稳定性由高到低排列顺序为:Actin=UBQ＞GAPDH＞nad5＞TUB＞18SrRNA，Actin和UBQ为优选内参基因。
　　2、首次建立了苹果Actin基因的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据已公布的Actin基因序列设计了特异性引物和TaqMan探针，以体外转录的RNA为标准品绘制标准曲线，并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行检验。结果显示建立的标准曲线相关系数达0.999，扩增效率为106.5％;该方法的引物和探针特异性强;检测灵敏度为1.48×10 copies·μL-1的cRNA，比常规RT-PCR高1000倍;重复性好，组内和组间重复变异系数均小于2.65％。
　　3、建立了苹果茎沟病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)外壳蛋白基因(coat protein，cp)保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针，以构建的ASGV-cp重组质粒为标准品绘制标准曲线，并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行检验。建立的标准曲线相关系数达0.999，扩增效率为96.8％;该方法特异性好，与苹果茎痘病毒（Applestem pitting virus，ASPV）、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、苹果锈果类病毒（Apple scar skin viroid，ASSVd）均无交叉反应;灵敏度为10copies·μL-1，比常规RT-PCR高1000倍;组内和组间重复变异系数均小于1％。表明该方法具有特异性强、灵敏高、重复性好的优点，适用于实际样品中ASGV的快速准确检测。
　　4、建立了苹果褪绿叶斑病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据ACLSV cp基因的保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针，以构建的ACLSV-cp重组质粒为标准品绘制标准曲线，并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。结果显示，以ACLSV-cp重组质粒为标准品建立的标准曲线相关系数达0.999，扩增效率为103.7％;建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法特异性好，与ASGV、ASPV和ASSVd均无交叉反应;灵敏度为100 copies·μL-1，比常规RT-PCR高100倍;组内和组间重复变异系数均小于0.84％。表明TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR方法具有特异性强、灵敏高、重复性好的优点，适用于实际样品中ACLSV的快速准确检测。
　　5、建立了苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法。根据ASPVcp基因的保守序列设计了特异性引物和TaqMan探针，以体外转录的RNA为标准品绘制标准曲线，并对该方法的特异性、灵敏性、重复性进行检验。建立的标准曲线相关系数达0.996，扩增效率为99％;该方法特异性好，与ASGV、ACLSV及ASSVd均无交叉反应;其最低检测限为1.31×102 copies·μL-1，灵敏度比常规RT-PCR高100倍;组内和组间重复变异系数均小于1.85％。该方法具有特异性强、灵敏高、重复性好的优点，适用于实际样品中ASPV的快速定量检测。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1 实时荧光定量PCR技术概述

1．1 实时荧光定量PCR基本原理

1．2 实时荧光定量PCR检测方法

1．3 实时荧光定量PCR技术的定量方法

1．4 实时荧光定量PCR在植物植物病理学研究中的应用

2 内参基因概述

2．1 常用的内参基因

2．2 内参基因的选择

3 苹果病毒病概述

3．1 苹果病毒病概况

3．2 苹果病毒的传播途径

3．3 苹果病毒病的防控措施

3．4 苹果潜隐性病毒的检测方法

3．5 三种苹果潜隐性病毒

4 本研究的目的意义

第二章 苹果六个内参基因的优选

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要仪器及试剂

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 总RNA的提取

2．2 总RNA的纯化及cDNA合成

2．3 六个内参基因的常规PCR扩增及其引物退火温度的筛选

2．4 六个内参基因的实时荧光定量PCR反应

2．5 六个内参基因的筛选

3 讨论

第三章 苹果Actin基因TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要试剂及仪器

1．3 总RNA的提取

1．4 cDNA的合成

1．5 引物与探针的设计与合成

1．6 阳性重组质粒的构建

1．7 cRNA标准品的制备

1．8 Actin基因TaqMan探针实时荧光定量PCR反应体系的建立

2 结果与分析

2．1 Actin基因的常规PCR扩增及其产物的回收

2．2 阳性重组质粒的构建及鉴定

2．3 cRNA的体外转录

2．4 实时荧光定量RT-PCR标准曲线的制作

2．5 实时荧光定量PCR与常规PCR灵敏度的对比

2．6 实时荧光定量PCR的重复性

2．7 实时荧光定量PCR的特异性

3 讨论

第四章 苹果茎沟病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 主要试剂和仪器

1．3 引物和探针的设计合成

1．4 总RNA的提取及cDNA的合成

1．5 阳性质粒标准品的构建

1．6 标准曲线的绘制

1．7 实时荧光定量RT-PCR反应体系的方法学测试

1．8 实际样品的检测

2 结果与分析

2．1 阳性质粒标准品的构建

2．2 标准曲线的建立

2．3 实时荧光定量RT-PCR特异性

2．4 实时荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR灵敏度的比较

2．5 实时荧光定量RT-PCR重复性

2．6 实际样品检测

3 讨论

第五章 苹果褪绿叶斑病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 重组质粒标准品的鉴定及标准曲线的绘制

2．2 实时荧光定量RT-PCR的特异性

2．3 实时荧光定量RT-PCR的灵敏度

2．4 实时荧光定量RT-PCR的重复性

2．5 实际样品检测结果

3 讨论

第六章 苹果茎痘病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 引物及探针的设计与合成

1．3 总RNA的提取及RT-PCR

1．4 阳性质粒的构建

1．5 标准品cRNA的制各及标准曲线的绘制

1．6 实时荧光定量RT-PCR反应体系的验证与实际样品检测

2 结果与分析

2．1 阳性质粒的构建

2．2 标准曲线的绘制

2．3 实时荧光定量RT-PCR的特异性

2．4 实时荧光定量RT-PCR的灵敏度

2．5 实时荧光定量RT-PCR的重复性

2．6 实际样品的检测结果

3 讨论

结论

参考文献

在读期间发表的论文

作者简历

致谢