人分泌磷蛋白2基因的克隆、原核表达与活性检测

摘要

提取人肝癌组织RNA,通过RT-PCR扩增人SPP2成熟蛋白编码区基因并克隆至原核表达载体pET-22b(+),将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,用Ni-NTA柱进行纯化,SDS-PAGE电泳及Western blot检测并证实目的蛋白的表达,通过重组蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用验证其生物学活性.重组质粒测序和酶切结果显示SPP2成熟蛋白基因已成功克隆到pET-22b(+).IPTG诱导重组菌后有25kDa大小的目的蛋白表达.优化诱导表达条件,获得可溶性表达的目的蛋白,纯化后纯度达90%,western blot表明其具有His标签抗原活性.重组SPP2成熟蛋白可抑制木瓜蛋白酶的水解作用(酪蛋白为底物),重量抑制比为1:3.1,抑制比活性为2511U/mg.