稀有密码子改造的人ZNF580基因及该基因原核表达的蛋白及多克隆抗体

摘要

本发明公开了一种稀有密码子改造的人ZNF580基因及该基因原核表达的蛋白及多克隆抗体，稀有密码子改造的人ZNF580基因，是SEQ ID No.1所示。本发明改造了人ZNF580基因中的稀有密码子，得到稀有密码子改造的人ZNF580基因，经实验证明改造的基因经原核表达，可以产生大量的ZNF580蛋白，因此解决了现有技术ZNF580基因在原核中表达不出来的难题；成功地表达并纯化了人ZNF580蛋白；并以ZNF580蛋白作为抗原成功制备了多克隆抗体。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别是涉及一种改造的基因及其表达和应用。

背景技术

动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是严重危害人类健康的常见病，是缺血性心脑血管 疾病的重要病理基础。AS斑块的主要特征是病灶中细胞内及细胞外脂质聚集、单核/巨噬细 胞浸润、泡沫细胞形成、主动脉平滑肌增生以及结缔组织成分聚集。近些年来，随着人们生 活方式和饮食结构的变化，AS所致的心脑血管疾病发病率在我国有上升趋势。AS是一种环 境因素与遗传因素所诱发的多基因病，目前还缺少十分有效的治疗措施。应用分子生物学技 术对心脑血管疾病患者和动物模型的大量研究，已经克隆出100多个AS相关基因，例如 apoAI、apoB、apoCI、apoCⅡ、apoCⅢ、LPL、LCAT、CEPT、ABBP-1、Ath-1、Ath-2、Ath-6 等等，并利用转基因及基因敲除动物证实它们的生理功能。然而，AS作为一种复杂的多基因 病，牵涉到一个庞大的基因调控网络，其发病机制至今尚未完全阐明，随着人类及各种模式 生物基因组序列测序的完成，未来一个重要的目标是阐明人体约3.5万个基因的功能。为了 有效防治AS，有必要深入研究与AS相关基因的功能。血浆低密度脂蛋白（low density  lipoprotein,LDL）水平持续升高与动脉粥样硬化的发病率呈正相关，血管内皮细胞是AS形成 及发展的始动环节。张文成等人以致动脉粥样硬化因素LDL诱导人脐静脉内皮细胞系 ECV304，采用差异显示逆转录PCR技术进行分析，以差异表达的新ESTs为探针，筛选人主 动脉cDNA文库，得到一个全长为1726bp的新基因cDNA全长（Genbank注册号：AF184939）， 该基因由人类基因命名委员会定名为ZNF580，ZNF580基因用SEQ ID NO.3所示。ZNF580 基因cDNA748-1266位碱基序列构成一个完整的开放阅读框架，该cDNA开放阅读框全长为 519bp，编码172个氨基酸组成的蛋白质，分子量约为18.7564kDa。经分子生物学网站进行 蛋白质的功能基序分析：其氨基端5-88位氨基酸序列为脯氨酸富含域，羧基端94-172位氨 基酸序列中含有三个串联重复的C2H2型锌指蛋白结构域，三个锌指符合C2H2型锌指蛋白 基序CX2CX3FX5LX2HX3H（其中X代表保守性差的氨基酸）。多组织Northern杂交证实 ZNF580基因在人多种组织中均有表达，其中在心肌、肾脏、胰腺组织中的表达量最高，大脑 表达次之，在胎盘、肝脏、骨骼肌、肺组织中表达量较低。LDL诱导内皮细胞使ZNF580基 因表达明显下调。ZNF580基因定位于人19号染色体19q13.42。将ZNF580编码区克隆到真 核表达载体pEGFP-C1上，转染人胚肾上皮细胞系HEK293、胃癌细胞系MGC803进行瞬时 表达，融合有绿色荧光蛋白EGFP的目的蛋白定位于细胞核。前期研究工作表明：ZNF580 基因编码一种与AS相关的具有调控作用的C2H2型锌指核蛋白转录因子。检索基因表达数 据库中有关ZNF580的相关信息显示，ZNF580受多条信号通路的调控，并通过调节靶基因的 开关或转录水平参与细胞增殖、分化与凋亡等过程。为了深入研究ZNF580蛋白在基因表达 调控及信号转导中的作用，有必要利用基因工程技术表达并纯化ZNF580蛋白，制备多克隆 抗体，从而为研究ZNF580基因的功能奠定基础。

经过研究发现，完全按照人ZNF580基因开放阅读框序列进行基因工程操作，人ZNF580 蛋白在原核中表达不出来。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的人ZNF580基因不能进行原核表达的不足，提供一 种能在原核中表达的稀有密码子改造的人ZNF580基因。

本发明的第二个目的是提供用稀有密码子改造的人ZNF580基因进行原核表达产生的 ZNF580蛋白。

本发明的第三个目的是提供用ZNF580蛋白制备的多克隆抗体。

本发明的技术方案概述如下：

稀有密码子改造的人ZNF580基因，是SEQ ID No.1所示。

用SEQ ID No.1所示基因进行原核表达产生的ZNF580蛋白，所述ZNF580蛋白氨基酸 序列由SEQ ID No.2所示，分子量约为18.7564kDa，等电点为10.13。

用ZNF580蛋白制备的多克隆抗体。

本发明的优点：

本发明改造了人ZNF580基因中的稀有密码子，得到稀有密码子改造的人ZNF580基因， 经实验证明改造的基因经原核表达，可以产生大量的ZNF580蛋白，因此解决了现有技术 ZNF580基因在原核中表达不出来的难题；成功地表达并纯化了人ZNF580蛋白；并以ZNF580 蛋白作为抗原成功制备了多克隆抗体。

附图说明

图1为ZNF580融合蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳（1：阴性对照：非IPTG诱导表达；2： 阳性结果：IPTG诱导表达；3：MARKER：蛋白质标准）。

图2为不同诱导时间ZNF580融合蛋白表达SDS-PAGE电泳。（1：1.5h诱导表达结果； 2：2.5h诱导表达结果；3：3.5h诱导表达结果；4：MARKER：蛋白质标准）

图3为亲和层析纯化ZNF580融合蛋白SDS-PAGE电泳。（1：MARKER：蛋白质标准； 2：对沉淀进行亲和层析纯化；3：对上清进行亲和层析纯化；4：凝胶扩散法纯化ZNF580融 合蛋白）

图4为肠激酶作用后纯化的ZNF580蛋白SDS-PAGE电泳。1：MARKER：蛋白质标准； 2：纯化的ZNF580融合蛋白；3：肠激酶作用后凝胶扩散法纯化的ZNF580目的蛋白）

图5为多克隆抗体Western blot分析。（ZNF580为目的蛋白；GAPDH为内参照蛋白）

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域的技术 人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。

实施例1

以人ZNF580cDNA为依据，根据大肠杆菌对密码子的偏好性，并在确保表达蛋白质的 氨基酸序列不变的情况下，进行了密码子改造，获得了稀有密码子改造的人ZNF580基因， 是SEQ ID No.1所示。

实施例2

一、材料与方法

1.1材料

PCR试剂盒，琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒，大肠杆菌BL21（DE3），T4DNA连接酶及 限制性内切酶等均购自大连宝生物工程有限公司。高纯度质粒小提试剂盒及肠激酶购自 TIANGEN BIOTECH，His·band蛋白纯化试剂盒购自德国Novagen公司。

1.2方法

1.2.1构建表达质粒

根据所应用表达质粒pET30a的特性，设计相应的肠激酶序列及限制性内切酶位点，由 上海生工生物技术服务有限公司进行全序列合成并连接到质粒pET30a中，命名为 pET30a-ZNF580。成功地构建了原核表达载体pET30a-ZNF580。

1.2.2表达目的蛋白

1.2.2.1大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备

取5ml大肠杆菌BL21于5ml离心管中，冰浴10min。在4℃于4000g离心10min，弃 尽上清。加入0.1M的冰冷CaCl₂水溶液0.5ml重悬菌体。冰浴20min，在4℃以4000g离 心10min，弃尽上清。加入0.1M的冰冷CaCl₂水溶液0.2ml重悬菌体。于4℃放置16h备用。

1.2.2.2重组质粒转化大肠杆菌BL21

取10μl重组质粒pET30a-ZNF580加入200μl大肠杆菌BL21（DE3）感受态中，轻轻混 匀，冰浴30min，42℃热休克90s，再冰浴90s，加入37℃预热的不含卡那霉素的LB液体 培养基800μl，37℃200rpm振荡培养1h，取200μl培养液均匀涂在含卡那霉素的LB固体 培养基上，凉干后37℃倒置培养16h，结果出现抗性菌落。

1.2.2.3重组质粒的酶切鉴定

将长出的菌落分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基中。在37℃140rpm振荡过夜。 在作好标记的每个试管中取5ml菌液提质粒（按照高纯度质粒小提试剂盒操作进行）。

用限制性内切酶Nco I和Xho I双酶切鉴定，酶切反应如下：在灭菌的0.5ml Eppendorf 管中加重组质粒DNA2μg，10×酶切缓冲液2μl，限制性内切酶Nco I和Xho I各1μl，最后 加水至总体积为20μl，在37℃保温6h。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果发现酶切 片段与预期的片段长度大小一致，表明重组质粒转化到大肠杆菌BL21中。

1.2.2.4IPTG诱导表达

1.2.2.4.1从含有pET30a空质粒的阴性单菌落的平板上和步骤1.2.2.2获得的固体培养基 上分别挑取含有pET30a空质粒的阴性单菌落和含重组质粒pET30a-ZNF580的阳性单菌落,， 分别接种于6ml含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃200rpm振荡培养过夜。

1.2.2.4.2分别将400μl含有重组质粒pET30a-ZNF580的菌液和含有pET30a空质粒的菌 液接种于4ml含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃200rpm振荡培养至OD600为0.96， 加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1mM，继续于30℃200rpm振荡3h，每隔 30min收集含有pET30a-ZNF580的菌液0.5ml，观察随时间变化的表达情况，离心收集沉淀。

1.2.2.5SDS-PAGE电泳鉴定表达产物

取2.5ml的步骤1.2.2.4.1获得的含重组质粒pET30a-ZNF580的菌液，接种于250ml的 含卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃200rpm振荡培养至OD600为0.96，加入IPTG至 终浓度为1mM，继续于30℃200rpm振荡3h，10000g离心10min收集菌体，加入5ml结 合缓冲液,超声破碎菌体（300W，每次10s，间歇20s，共20次），14000g离心20min。取 上清和沉淀做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,发现预期表达产物存在于上清中。预期表达的蛋白分 子量约为24.3kDa,经电泳可见24.3kDa处有明显的新生区带，表明成功表达了ZNF580融合 蛋白（如图1）。于30℃200rpm振荡3.5h，分别在1.5h、2.5h和3.5h收集含有pET30a-ZNF580 的菌液0.5ml，观察随时间变化的表达情况，结果表明诱导表达2.5h到3.5h，表达产物的量 达到高峰（如图2）

1.2.3分离纯化重组蛋白

1.2.3.1采用His·band蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白

首先将上清用0.45μm的滤膜过滤，随后按下述方法制备层析柱，并进行纯化：

①树脂的准备与平衡

进行柱层析纯化之前需要准备：5倍体积1×离子化缓冲液，13倍体积1×结合缓冲液，6 倍体积的1×漂洗缓冲液以及6倍体积的1×洗脱缓冲液。应用Novagen聚丙烯空色谱柱（货 号69673-3），空柱首先加几毫升灭菌的去离子水，用一只手指（戴手套）轻推柱的上部，浸 湿滤芯部分，使液体能正常流动。

②将HiS-Bind树脂轻柔颠倒彻底重悬树脂。用一个阔口吸头将2.5ml树脂悬液加入一 个准备好的空色谱柱中，待树脂在重力作用下自然沉降。

③当树脂沉降、保存液的液面降至树脂表面时，按以下顺序清洗、离子化和平衡色谱柱；

A:3倍体积灭菌去离子水

B:5倍体积1×离子化缓冲液

C:3倍体积1×结合缓冲液

④待结合缓冲液下降至层析介质表面，小心加入步骤1.2.2.5获得的上清。

⑤10倍床体积1×结合缓冲液洗

⑥6倍体积1×漂洗缓冲液洗

⑦1倍体积1×洗脱缓冲液洗脱结合蛋白。

洗脱液分段收集，1ml收集一管。首先采用PAGE和SDS-PAGE进行电泳，观察蛋白分 离情况，结果表明蛋白被纯化，然后对每管蛋白液进行定量测定，得出每管的蛋白（融合蛋 白）浓度值,进行SDS-PAGE电泳，从凝胶中切下所需目的条带，可见ZNF580融合蛋白被纯 化（如图3）。

1.2.3.2制备纯化的ZNF580蛋白

取融合蛋白1.5mg/ml加入10×缓冲液10μl，加入重组肠激酶3U，于23℃作用10h，进 行SDS-PAGE电泳，电泳后,将凝胶条带冷冻后研碎，放入制备好的磷酸盐缓冲液100ml中， 密封静置48h，4000rpm离心后，取上清冷冻，经真空干燥重新溶于缓冲液中，利用BCA 法进行蛋白测定，结果蛋白浓度为1.2046mg/ml。蛋白纯化后做SDS-PAGE，可见ZNF580 蛋白被纯化（如图4），纯化的蛋白分子量与预期的18.7564kDa相一致。

实施例3

一、制备多克隆抗体方法

1.1抗原准备

将实施例2获得的纯化的ZNF580蛋白，用pH=7.4的0.01M PBS将其稀释到0.5mg/ml。 抗原乳化采用双注射器互推法。

1.2免疫程序

取4只新西兰兔，其中2只作为对照组，对照组用灭菌的三蒸水（使用量与实验组的体 积相同），按下述实验组相同的免疫程序进行免疫。

1)取1ml纯化的ZNF580蛋白（0.5mg/ml），加入等体积弗氏完全佐剂乳化后，新西兰 兔背部皮下多点注射；

2)经一个月第二次免疫,取1ml纯化的ZNF580蛋白（0.5mg/ml），加入等体积弗氏不 完全佐剂乳化后，新西兰兔背部皮下多点注射；

3)第二次免疫后的第10天进行第三次免疫，取1ml纯化的ZNF580蛋白（0.5mg/ml）， 加入等体积弗氏不完全佐剂乳化后，新西兰兔背部皮下多点注射；

4)第三次免疫后的第10天进行第四次免疫，取1ml纯化的ZNF580蛋白（0.5mg/ml）， 加入等体积弗氏不完全佐剂乳化后，新西兰兔背部皮下多点注射；

5)第四次免疫后1个月进行冲击免疫，取2ml纯化的ZNF580蛋白（0.5mg/ml），新西 兰兔腹腔注射；

6)冲击免疫后的第3天，兔耳静脉采血液2ml，室温凝固后，分离血清，用琼脂扩散法 测定多抗滴度。

7)冲击免疫后的第4天，新西兰兔颈动脉放血，收集血液，4℃放置过夜，待血块收缩 后分离血清，分装保存。

1.3抗ZNF580多抗效价测定

多抗用ELSIA法测定效价

l)包被酶标板:用包被液稀释纯化的ZNF580蛋白至0.025μg/ml，100μl/孔，4℃过夜。

2)封闭:次日用PBST洗涤液洗涤2次，每次2min,之后用10%小牛血清封闭液封闭酶 标板，37℃水浴l h，PBST洗涤液洗涤。

3)加样:加入稀释过的多抗100μl/孔（稀释倍数见表1，多抗为本实施例步骤1.2中的7） 获得的血清），37℃水浴2h，PBST洗涤液洗涤。

4)加二抗:加入1:4000的山羊抗兔IgG-HRP，37℃水浴45min，PBST洗涤液洗涤。

5)底物:分别加入显色液A和显色液B各50μl，37℃水浴15min。

6)终止:加入终止液100μl，酶标仪450nm读数。

二、结果

多克隆抗体效价的测定

纯化后的抗ZNF580蛋白的多抗用0.025μg/ml ZNF580蛋白包被的酶标板测定多克隆抗 体的效价，用不同稀释倍数的抗ZNF580蛋白的多抗作为一抗，山羊抗兔HRP/IgG为二抗得 结果如下，抗体效价在1/16000。

表1多克隆抗体效价的测定

多克隆抗体特异性的测定

经Western blot分析，结果发现，对照组家兔血清中不存在抗ZNF580蛋白的抗体，实验 组家兔血清进行Western blot分析，在18kDa附近出现条带如图5，说明多克隆抗体具有很 好的特异性，本实验成功制备了兔抗ZNF580蛋白的多克隆抗体。