猪血凝性脑脊髓炎病毒PK细胞膜受体的鉴定

摘要

在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达猪血凝性脑脊髓炎病毒(Hemagglutinating encephalomyelitis virus,HEV)67N株S蛋白片段,纯化后免疫家兔,获得兔抗HEV-S蛋白特异性抗体;提取PK细胞膜蛋白,SDS-PAGE电泳后,转印NC膜,以纯化的S1蛋白代替病毒,利用改进的病毒铺覆蛋白结合试验(COPBA)对PK细胞膜受体进行鉴定.结果扩增获得1 797 bp的S1目的基因片段,用S1特异性引物和AOX1通用引物PCR鉴定结果表明,实验成功地构建了重组酵母表达质粒,重组酵母菌经1%甲醇诱导,在培养基上清中检测到73 kD目的蛋白.Western blot分析发现,该重组蛋白可与HEV多克隆抗体发生特异性血清反应;提取的PK细胞膜蛋白转膜后与纯化的S1目的蛋白结合,DAB显色发现在90 kD处有清晰的蛋白带.