β-琼脂糖酶Ⅰ DagA的原核表达和活性鉴定

摘要

采用PCR技术从假别单胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)19262基因组DNA中获得β-琼脂糖酶Ⅰ基因(dagA)及去除信号肽的编码序列dagA(),分别与载体pET21a连接后转人大肠杆菌(Escherichia coli)ER2566中,共表达分子伴侣Ds-bC及FkpA,筛选出以包涵体为主要表达形式的高效表达体系:ER2566-pET21a-dagA()-DsbC菌株.包涵体蛋白达到菌体总蛋白的60%左右.包涵体用8mol/L尿素溶解、镍离子亲和层析纯化和梯度稀释复性.SDS-PAGE检测表明,复性后的DagA蛋白相对分子质量约为30.8 kD,且具有水解琼脂糖的生物活性.酶学特性分析表明,在pH 4.8～6.8范围内,DagA蛋白活性保持60%以上,最适pH 5.8;在温度37～60℃均有活性.最适温度为55℃.