重组β-琼脂糖酶ⅠDagA的原核表达及活性鉴定

摘要

琼脂糖酶能够特异性降解琼脂糖，在很多方面有重要应用。琼脂糖酶能降解琼脂产生琼脂寡糖，琼脂寡糖具有多种特殊功能而引起人们越来越多的关注。琼脂糖降解菌主要存在于海洋中，来源有限，限制了琼脂糖酶的大规模应用。拓宽琼脂糖酶的来源，特别是采用基因工程技术生产琼脂糖酶，对大力推广琼脂糖酶的应用及开发琼脂糖酶酶解产物中具有活性功能物质的应用具有一定的价值和意义。 原核表达系统是目前掌握最为成熟的表达系统。pET系统是在E．coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。故本研究采用常用的pET及大肠杆菌原核表达系统，试图获得大量目的蛋白。1996年NCBI公布了来自Pseudoalteromonax atlantica的β-琼脂糖酶Ⅰ全基因序列dagA(M73783)，但对β-琼脂糖酶Ⅰ DagA高效表达的研究目前尚未见报道。比较目前报道的多种β-琼脂糖酶，可以看出尽管不同来源的β-琼脂糖酶的功能相似，但它们在氨基酸序列、分子量、底物特异性、反应特性等方面存在着很大的差异。为了开发和应用β-琼脂糖酶ⅠDagA，本文克隆β-琼脂糖酶Ⅰ基因dagA，采用共表达分子伴侣的方法，提高目的蛋白表达效率，为构建B·琼脂糖酶稳定的原核高效表达系统奠定实验基础。获得的主要研究结果如下： 1.从Pseudoalteromonas atlantica 19262基因组DNA克隆出β-琼脂糖酶Ⅰ全基因dagA及切除信号肽序列的编码序列dagA(▽)，通过构建载体、转化、筛选鉴定获得了重组DagA高表达菌株ER2566-pET21a-dagA(▽)-DsbC和ER2566-pET21a—dagA(▽)-FkpA，成功地实现了β-琼脂糖酶ⅠDagA在大肠杆菌原核表达系统中的表达。 2.对包涵体形式表达DagA的重组菌ER2566-pET21a-dagA(▽)-DsbC的培养及诱导条件进行了优化，提高了包涵体的产量，并对包涵体复性的条件进行了初步的探索。通过优化重组菌ER2566-pET21a-dagA(▽)-FkpA的诱导条件实现了重组DagA的分泌表达，为β-琼脂糖酶ⅠDagA的深入研究和工业化生产应用奠定了重要基础。 3.研究了dagA基因中信号肽序列及分子伴侣DsbC、FkpA对重组DagA表达的影响。在不同宿主菌中采用相同的载体及分子伴侣，但仅在ER2566成功实现了DagA的大量包涵体形式表达和分泌表达。切除信号肽序列的dagA(▽)，添加ATG启动子，在大肠杆菌菌株ER2566体内可明显提高目的蛋白的表达。共表达分子伴侣DsbC未能提高DagA的分泌表达，推测是表达出的DsbC以无活性形式存在，在菌体内未能起到分子伴侣作用所致，而分子伴侣FkpA．则在ER2566菌株中明显提高了目的蛋白的分泌表达。 4.初步研究了重组β-琼脂糖酶ⅠDagA的活性和酶学性质。在pH4.8～pH6.8范围内，酶活性保持60％以上，最适pH约为5.8；在温度37～60℃均有活性，最适温度为55℃，与其他国内报道的β-琼脂糖酶相比，最适温度提高了10℃以上。NaCI、MgCl2、CaCl2盐溶液对DagA酶活性有明显的促进作用，但Na2EDTA盐溶液对其有明显的抑制作用。本研究确立了β-琼脂糖酶ⅠDagA的高效原核表达体系，并初步研究了重组β-琼脂糖酶ⅠDagA的酶学特征，为β-琼脂糖酶ⅠDagA的开发和工业化生产应用奠定了重要基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1.1琼脂糖酶概述

1.1.1琼脂糖酶的来源

1.1.2琼脂糖酶的分类及反应机理

1.1.3琼脂糖酶的应用

1.2琼脂糖酶的研究进展

1.3原核表达的特点

1.3.1原核表达的优点

1.3.2包涵体及复性

1.4分子伴侣

1.5研究目的，意义及技术路线

1.5.1研究目的和意义

1.5.2技术路线

第二章实验部分

2.1实验材料

2.1.1菌株与质粒

2.1.2主要试剂、配制方法

2.1.3主要仪器

2.1.4引物

2.2方法

2.2.1 dagA基因的克隆及表达载体的构建

2.2.2 FKpA、DsbC质粒共转化和诱导表达

2.2.3包涵体表达条件优化及复性、纯化

2.2.4分泌表达条件优化及纯化

2.2.5酶活性鉴定及酶学特征的分析

2.3结果与分析

2.3.1 dagA基因的克隆和序列分析

2.3.2表达载体构建

2.3.3 β-琼脂糖酶ⅠDagA表达系统的筛选

2.3.4 DagA表达条件优化

2.3.5 DagA酶活性鉴定

2.3.6 DagA的酶学特征分析

2.4讨论

2.4.1载体构建及表达体系建立

2.4.2 DagA的表达及纯化

2.4.3 DagA的基本酶学性质

2.5结论与展望

参考文献

附录

致谢

作者简介